高效液相色谱讲座Ⅲ高效液相色谱仪器系统(下)
讲座高效液相色谱讲座高效液相色谱仪器系统（下）包绵生林丛敬张玉奎（中国科学院大连化学物理研究所）3-2进样系统进样系统是将待分析样品引入色谱柱的装置。对于液相色谱的进样装置，要求重复性好，死体积小，保证中心进样，进样时对色谱柱系统流量波动要小，便于实现自动化等。进样系统包括取样、进样两个功能。而实现这两个功能又有手动和自动两种方式。注射器进样适用在压力100公斤厘米2以下。用110微升微量注射器把样品注入专门设计与色谱柱相联的进样头内。这种进样方式可以获得比其它任何一种进样方式都要高的柱效。而且价钱便宜，结构简单，操作方便。但是操作压力不能过高，隔垫容易产生记忆效应，特别是进样重复性只能达到12%。停流进样，这种进样方式无法取得精确的保留时间、重复性也差。只是在没有进样阀的情况下，才采用的进样方式。阀进样进样阀分为定体积（样品）和不定体积两类。可以直接用于高压（350400公斤厘米2下，把样品送入色谱柱，不需要停流。进样量坑由固定体积的定量管或微量注射器控制（常压），所以重复性好。如果装上电动或者气动的驱动装置，可做到简单的自动进样。但是比注射器进样柱效下降10%左右。图3-17示出几种不同结构进样阀的示意图。A定量管体积较大，所以常用微量注射器定量。也可以用阀切换停留时间来控制进样量，当然这需要有经验的操作者才能做到。B注射器和定体积量管两用结构，用注射器时进样量限在定量管体积范围内。定量管最小体积5微升。C普通进样阀，进样量5微升以上，若需改变进样量，则更换定量管。D属于微量进样阀，进样量一般在1微升以下，最小0.2微升。因为其通道即是定体积量管，所以对于每一只阀来讲它的进样体积是固潭定的。E结构基本与前一种相同，只是阀在取样或者进样任一位置，样品流路总是连通的。自动进样器进样在程序控制器控制下，可自动进行取样、进样、清洗取样系统等一系列动作。操作者只须将样品按顺序装入贮样机构。下面介绍几种比较典型的自动进样装置。工作步骤：1电机带动贮样盘旋转，将待分析样品瓶置于取样针下方。2电机正转丝杆带滑动块向下移，把取样针刺入样品瓶塑料盖，滑块继续下移，将瓶盖推入瓶内（如图3-19所示），在瓶盖挤压下样品经管道流入进样阀定量管，完成取样动作。3进样阀切换完成进样。4电机反转，丝杆带动滑块上移取样针恢复原位。类似这种结构的进样器有Micromeritics的MODEL725和偷津SIL-2AS等型号。工作步骤：1链轮拨动样品链，将待分析样品瓶置于取样针下。2转角机构由尚虚橄线位置米转到实线位置，并下降扦入样品瓶内。3动泵正转将样品吸入定休积量管。完成取样动作。4进样切换，完成进样。5转角机构返回虚线位置。6蠕动泵反转打清洗液，清洗取样系统。7进样阀复原。8蠕动泵正转吸入空气干燥取样管路。工作步骤：1取样针升起；2微机控制座标贮样盘将待分析样品瓶置于取样针下；3取样针下降，扦入样品瓶内；4启动吸样泵，取样量由微机控制；5取样针升起将样品瓶送回原处；6取样针下降扦入取样针扦入口；7方式阀切换，由流动相将样品载入色谱柱系统；8吸样泵复位，方式阀复位。3-3色谱柱系统色谱柱是高效液相色谱滓仪的核心部件，要求分离度高，柱容大，分析速度快。而这些性能不仅与色谱柱有关，也和它的外部结构、装填、使用技术等有关。1色谱柱的结构a色谱柱的长度：理论上色谱柱的柱长与柱效成正比关系。所以增加色谱柱的长度可以提高柱子效率。由于微粒固定相的采用不得不对柱长提出限制，目前的装填设备和技术只能保证柱长在100250毫米之间获得好结果。（特殊要求除外）。b色谱柱内径：对其内径尺寸和内壁光洁度有一定要求。1)内径尺寸：常用分析的色谱柱内径：国外是3/16"英吋（即4.6毫米）国内是5毫米。由于柱技术的发展，内径2毫米的色谱柱已作为常用柱径。因为它可以获得与粗柱径基本相同的结果，而其溶剂日耗量约为5毫米柱径的1/6。2)光洁度；柱内壁要求精细地抛光加工，绝对不允许有轴向沟槽。而径向沟槽虽然无明显地对流型扩散影响，但最好还是没有沟槽，通常对内壁光洁度要求在 8以上。c色谱柱的接头：色谱柱两端的接头是为了便于连接色谱系统。它的结构合理与否，要看液流流经这些连接处时产不产生如图3-22所示的湍流和涡流，防止样品进入柱床前稀释，以减小甚至避免“柱外效应”的影响。采用图3-23注射器进样结构，可得到满意结果。而如图3-24所示阀进样结构，因为样品通过较长管路，稀释现象严重，又不能集中进入柱床。经过几处连接不可避免产生湍流和涡流。所以阀进样不如合理结构的注射器进样。一支色谱柱的优劣，除了与装填有关（柱内效应）外，还和它两端接头有关（柱外效应）。所以有必要分析一下目前常用的各种柱接头结构的合理性。如图3-25所示，四种接头中，A和B比较合理。A采用无死体积接头及很薄的网片作过滤板，这种结构适用于2毫米以下的柱径。B在出口端塞入一块聚四氟乙烯填充物（如图B涂黑部分）。其作用为减小可能产生的涡流，连接管直接和过滤板相接，避免接头通孔造成的死区。这种结构用在4毫米以上内径的色谱柱效果较佳。C、D两种接头其结构不合理性无需更多说明。2色谱柱的装填：为了得到高的柱效，所用填料越来越向微粒发展。为此不得不使用湿式装填即淤浆装柱法。所谓淤浆装柱法，即以一种或数种配制合适的溶剂作为分散，悬浮介质。经超声处理使其微粒在介质中高度分散并呈现悬浮状态即匀浆。然后用加压介质在高压下将匀浆压入柱管中，制成具有均匀，紧密填充的高效液相色谱柱。淤浆装柱方法较多，例如：“平衡密度法”、“粘度法”、“稳定淤装法”和“非平衡密度法”等等。具体采用哪种方法，和填料的原料，性质、使用条件等有关。但是不管采用何种方法，若想得到理想的高柱，必须满足下述条件：a制备成的匀浆，其固定相粒子应在介质中高度分散并悬浮；b匀浆配制稠度，即固定相与作为匀浆介质的溶剂比例，在匀浆罐容积允许范围内宜大一点；c装填时的压力，根据固定相粒度、柱径、柱长诸因素而定。对于常规柱控制在300null600公斤厘米2可得到满意的效果。而粒子小于5微米，柱径在2毫米以下，柱长150250毫米时，压力需要提高到600800公斤厘米2甚至更高。注意：加压介质选择，尽可能接近或者等同于分析冲洗条件。这样可以省略溶剂活化和柱性能调整等步骤。必须指出，高效液相色谱柱的获得，装填技术是重要环节。然而根本问题还在于固定相本身的性能优劣。以及与其相匹配的色谱仪器结构系统是否合理有关。3色谱柱的使用技术：a柱子连接对于k值很接近两个以上组分，用通常高效柱无法分离时，除了改变流动相的组成可能有一定效果外，唯一方法只有增加色谱柱的理论塔板数。为此通过减小固定相粒度和增加柱长可达目的。但因装填设备及技术所限，不能超出常规。因此设想将两根或多根高效柱连接起来，从而获得两倍以至于几倍柱效。理论上似乎没有问题，实际得到结果是4根2250毫米（N=8万米）柱效的高效柱，连接后为4250毫米柱效（N7万米）。说明连接是可行的，结果比较满意。不过对每根单一的色谱柱而言，柱效约损失1015，还达不到理论值。连接方法如图所3null27示。b保护柱即在分析柱的入口端加一段5-30毫米长，装有与分析柱相同固定相的短柱。可以经常而且方便的更换，因此起到保护，延长分析柱寿命的作用。由于采用保护柱使分析柱损失一定柱效。可是，换一根分析柱不仅浪费（柱子失效只是柱端局部），而且费事（有关参数需要重新校正）。而换一段保护柱对色谱系统的影响则可以忽略不计。所以即使损失一点柱效也是可取的。c色谱柱的切换柱切换技术是近年液相色谱所发展起来的应用技术。如图3-28示意。用两只结构相同，动作同步的切换阀，在对应接咀间接入不同性能、不同规格的分析柱。根据需要可以完成更换色谱柱，改变冲洗条件，反冲，及馏分切割等流程。配合以微机控制是智能型液相色谱仪的必备部件。3null4色谱柱恒温装置与馏分收集器1色谱柱恒温器装置液相色谱柱升温有利于降低溶剂粘度和提高样品溶解度，达到充分分离和使保留值重复稳定。特别对需要精确测定保留体积的样品分析尤其重要。除特殊需要外，一般液相色谱常规分析不需要升温。介绍几种常用升温装置：a水浴式用恒温水浴槽给色谱柱夹套内注入所需温度的循环水，借助水的温度使色谱柱恒定于某温度。夹套如图3-29所示。b电加热式在金属块（常用铝）上按装电加热元件，温度控制器控制电加热元件电流大小，可以使金属块恒定温度，将色谱柱置于两块金属之间，由金属块传递温度得到恒温。c恒温箱式即把5中所用装有电加热元件的金属块，按装在具有保温性能的箱内，使整个箱内恒定在所需枰要的温度。为了保证安全，运转时以一定流速向箱内吹氮，以免万一有机溶剂泄漏浓度过高发生危险。用于液相色谱柱恒温装置的最高温度不超过100，否则流动相气化会使分析工作无法进行。2馏分收集器：对于以分离为目的的制备色谱，馏分收集器是必不可少的。现代的馏分收集器，可以按样品分离后组分流出的先后次序，或按时间，或按色谱峰的起止信号，根据预先设定好的程序自动完成收集工作。图3-30是馏分收集器的结构流程示意图。工作原理在无组分流出时，切换阀3与冲洗液回收瓶连接，可回收一部分冲洗剂。当第一个组分流出时，检测器2通过控制器4令阀3切换至收集位置，令试管盘前移一格，收集一个组分。当第一个组分结束时，检测器通过控制器令试管盘前移一格。当第二个组分流出时，控制器令试管盘再前移一格，收集第二个组分以此重复，直至最后一个组分收集结束后，控制器令阀3切回原处，完成一个样品的收集工作。与仪器系统有关的检测器和数据收集及处理装置作为另外单独一讲介绍，本文不再涉及。（上接235页）比变化小。表7是按上述实用的原则测定的校正因子，由于各台仪器的结构不同，所以气流比不同，校正因子不同。总之，根据过去在生产实践中应用文献中的火焰离子化校正因子进行归一化法计算，结果甲烷偏低，其他组分偏高，设计与实际情况不符，其原因是甲烷、乙烷、丙烷的校正因子偏低和对浓度较高的低碳烃线性差，所以应按照分析实际的要求，优选分析条件，实测校正因子。三、问题讨论热导池检测器的工作原理是基于样品组分物质和载气的热导系数差异性，组分浓度在检测限以上时，其浓度与热导系数差值有良好的线性关系。载气和组分物质的热导系数是物质的固有属性，具有共同特点的池体、热敏元件的几何形状、桥电流、池体温度、载气组成及流速均是恒定的，所以不同热导检测器的校正因子差异不大，文献中校正因子可以通用。火焰离子化检测器对能够电离的含碳有机化合物灵敏度很高，是分析微量烃类的良好检测器。但因其离子化效率低，样品中的高浓度组分易超过线性范围。影响火焰离子化校正因子的因素很多：如：燃气（H2、助燃气（空气），载气（N2喷嘴、极化圈、收集极的形状及位置高低都对物质的响应值有很大影响，应根据自已的分析要求选定分析条件实测校正因子，无标样检查和对照试验，不能盲目采用文献校正因子。参考文献1 孙传经，气相色谱分析原理与技术，化学工业出版社，北京，434页，1979. 清木，环境化学，3,79(1984)3 孙传经，气相色谱分析原理与技术，化学工业出版社，北京，128页，1979.4 同上，137页，19795 中国科学院大连化学物理研究所，气相色谱法，科学出版社，北京，1972.（收稿日期：1984年9月l5日）
