猪血清IgG的分离纯化与鉴定
组员 陈忠浩 赵静杰 郭献贵 于芳萍发言人 郭献贵 血清 球蛋白的分离纯化与鉴定 2 Contents 材料与方法 结果与讨论 总结与感想 3 一 材料与方法 一 试验材料 1 供试材料 采用猪血为实验材料 采自宁波方兴食品有限公司屠宰场 收集健康肉猪颈动脉血液 室温下放置1 2h 析出血清 于4 8000r min离心10min 除去血球和纤维蛋白原后 取上层血清 20 冰箱内保存备用 4 2 主要试剂 5 6 3 仪器设备 7 二 试验方法 8 1 猪血清IgG的提取 正辛酸法 准确量取猪血清40mL于500mL烧杯中 加入60mmol LpH4 0醋酸缓冲液160mL 用氢氧化钠溶液调pH4 5 以每毫升稀释液加入25 L正辛酸的比例 在磁力搅拌条件下缓慢加入正辛酸 室温搅拌30min 4 5000r min离心30min 弃去沉淀 上清液4 预冷 以1mL上清液加0 227g硫酸铵的比例 缓慢加入硫酸铵粉末 边加边搅拌 室温下继续搅拌30min 5000r min离心15min 将沉淀溶于20mL生理盐水中 透析过夜 离心去沉淀 上清液即为粗提IgG 9 2 猪血清IgG的纯化 将上述IgG粗品溶于少量生理盐水后装入透析袋 悬于装有0 01mol L pH7 4的PBS的大烧杯中 于磁力搅拌器上4 透析24h 每6h换一次液 1 透析脱盐 10 取2g预处理的DEAE 52纤维素 装成1 5 30cm 柱床高25cm层析柱 缓冲液A 25mmol LTris HCl pH8 8 35mmol LNaCl 平衡 取2mL上述透析去盐母液进层析柱 上样后先用缓冲液A平衡 至流出液在280nm波长洗脱曲线变得平直止 以等量缓冲液A和缓冲液C 25mmol LTris HCl pH8 8 500mmol LNaCl 连续梯度洗脱 控制流速1mL min 上样15min后分步收集并记录波峰 2mL 管 合并同一波峰收集管 再用PBS溶液透析 并进行分析鉴定 2 DEAE 52纤维素离子交换层析纯化IgG 11 3 提取液蛋白含量测定 Folin 酚法 配制标准牛血清白蛋白进行Folin 酚法实验 用分光光度计测定梯度浓度标准蛋白的OD280 以蛋白质的浓度为横坐标 OD280值为纵坐标 绘制标准曲线 各粗IgG样品液定容至100mL 按Folin 酚法操作 通过标准曲线计算样品的蛋白质浓度 12 4 猪血清IgG分子量测定 SDS PAGE 配制SDS PAGE凝胶 将透析过的IgG样品液和标准蛋白液与上样缓冲液混合后在沸水浴中加热5min 各取20 L加入凝胶板的样品槽中 进行电泳 取出凝胶平板 将凝胶浸泡在染色液中 20min后用脱色液脱色 脱色后的凝胶在凝胶成像仪上拍照 分析 根据标样做出标准曲线计算样品IgG分子量 13 电泳设备 14 二 结果与讨论 一 正辛酸提取猪血清IgG试验结果 血清提取出的球蛋白粗品为浅黄色胶状物质 二 猪血清IgG纯化结果 透析后的蛋白质颜色明显变浅 呈透明状 1 IgG的透析结果 15 保留时间0 1 6h为缓冲液A洗脱第一峰 1 6h开启缓冲液A C线性梯度洗脱 获得第二峰 图示两色谱峰分离效果较好 分辨率高 无重叠 2 DEAE 52纤维素层析纯化IgG结果 用DEAE纤维素离子交换柱进行纯化 以OD280nm为纵坐标 洗脱时间为横坐标 绘制洗脱色谱图 16 图福林 酚试剂法测蛋白质浓度标准曲线 三 提取液蛋白含量测定结果 1 标准曲线 17 分别将低盐峰和高盐峰样品吸光度代入蛋白质标准曲线 计算求得低盐峰样品蛋白质含量1 45mg mL 高盐峰样品蛋白质含量为 74mg mL 2 样品IgG含量测定 18 四 SDS PAGE测IgG分子量结果 猪血清 纯化的IgG样品经SDS PAGE电泳结果如下 1标准蛋白2猪血清3纯化的IgG样品 19 IgG样品经预处理过程中巯基乙醇的作用而打开二硫键 还原成两条单链 再进一步与SDS结合成带大量负电荷的SDS 蛋白复合物 SDS PAGE电泳呈现两条较浓的条带 猪血清球蛋白经正辛酸法提取 DEAE纯化后 所得IgG较纯净 基本无其它杂蛋白 表明该提取纯化工艺能得到较纯净的免疫球蛋白 20 1 标准曲线制作 以标准蛋白质相对分子质量的对数 lgMw 为纵坐标 蛋白质迁移距离为横坐标 得到以下标准曲线 21 2 IgG样品分子量测定结果 根据样品IgG的迁移距离从标准曲线上查出其相对分子质量如下 重链约55000 轻链约24000 即猪血清IgG球蛋分子量为16万左右 与文献 蛋白质技术手册 报道结果一致 22 四 总结与感想 总的来说 本次试验还是成功的 虽然说试验方法在细节上还有很多需要改进的地方 但实验目的已经达到 本次实验课是一次不同于以往的自主性实验课程 需要我们自己查找资料 设计实验方案 更需要我们独立思考 通过团队合作完成实验 23 这种以学生为主 老师为辅的实验课程让我们想得更多 学得更多 得到的也更多 在我们开展讨论的过程中 同学们互相学习 对实验的设计流程有了深刻的认识 实验其间 对于细节上的问题我们更加耐心 为将来毕业论文的开展提供了有力的基础 24 谢谢
