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猪血清IgG的分离纯化与鉴定

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常见问题

1、组员陈忠浩赵静杰郭献贵于芳萍发言人郭献贵血清球蛋白的分离纯化与鉴定 2 Contents 材料与方法结果与讨论总结与感想 3 一材料与方法一试验材料 1 供试材料采用猪血为实验材料采自宁波方兴食品有限公司屠宰场收集健康肉猪颈动脉血液室温下放置1 2h 析出血清于4 8000r min离心10min 除去血球和纤维蛋白原后取上层血清 20 冰箱内保存备用 4 2 主要试剂 5 6 3 仪器设备 7 二试验方法 8 1 猪血清IgG的提取正辛酸法准确量取猪血清40mL于500mL烧杯中加入60mmol LpH4 0醋酸缓冲液160mL 用氢氧化钠溶液调pH4 5 以每毫升稀释液加入25 L正辛酸的比例在磁力搅拌条件下缓慢加入正辛酸室温搅拌30min 4 5000r min离心30min 弃去沉淀上清液4 预冷以1mL上清液加0 227g硫酸铵的比例缓慢加入硫酸铵粉末边加边搅拌室温下继续搅拌30min 5000r min离心15min 将沉淀溶于20mL生理盐水中透析过夜离心去沉淀上清液即为粗提IgG 9 2 猪血清IgG的纯化

2、将上述IgG粗品溶于少量生理盐水后装入透析袋悬于装有0 01mol L pH7 4的PBS的大烧杯中于磁力搅拌器上4 透析24h 每6h换一次液 1 透析脱盐 10 取2g预处理的DEAE 52纤维素装成1 5 30cm 柱床高25cm层析柱缓冲液A 25mmol LTris HCl pH8 8 35mmol LNaCl 平衡取2mL上述透析去盐母液进层析柱上样后先用缓冲液A平衡至流出液在280nm波长洗脱曲线变得平直止以等量缓冲液A和缓冲液C 25mmol LTris HCl pH8 8 500mmol LNaCl 连续梯度洗脱控制流速1mL min 上样15min后分步收集并记录波峰 2mL 管合并同一波峰收集管再用PBS溶液透析并进行分析鉴定 2 DEAE 52纤维素离子交换层析纯化IgG 11 3 提取液蛋白含量测定 Folin 酚法配制标准牛血清白蛋白进行Folin 酚法实验用分光光度计测定梯度浓度标准蛋白的OD280 以蛋白质的浓度为横坐标 OD280值为纵坐标绘制标准曲线各粗IgG样品液定容至100mL 按Folin 酚法操作通过标准曲

3、线计算样品的蛋白质浓度 12 4 猪血清IgG分子量测定 SDS PAGE 配制SDS PAGE凝胶将透析过的IgG样品液和标准蛋白液与上样缓冲液混合后在沸水浴中加热5min 各取20 L加入凝胶板的样品槽中进行电泳取出凝胶平板将凝胶浸泡在染色液中 20min后用脱色液脱色脱色后的凝胶在凝胶成像仪上拍照分析根据标样做出标准曲线计算样品IgG分子量 13 电泳设备 14 二结果与讨论一正辛酸提取猪血清IgG试验结果血清提取出的球蛋白粗品为浅黄色胶状物质二猪血清IgG纯化结果透析后的蛋白质颜色明显变浅呈透明状 1 IgG的透析结果 15 保留时间0 1 6h为缓冲液A洗脱第一峰 1 6h开启缓冲液A C线性梯度洗脱获得第二峰图示两色谱峰分离效果较好分辨率高无重叠 2 DEAE 52纤维素层析纯化IgG结果用DEAE纤维素离子交换柱进行纯化以OD280nm为纵坐标洗脱时间为横坐标绘制洗脱色谱图 16 图福林酚试剂法测蛋白质浓度标准曲线三提取液蛋白含量测定结果 1 标准曲线 17 分别将低盐峰和高盐峰样品吸光度代入蛋白质标准曲线计算求得低盐

4、峰样品蛋白质含量1 45mg mL 高盐峰样品蛋白质含量为 74mg mL 2 样品IgG含量测定 18 四 SDS PAGE测IgG分子量结果猪血清纯化的IgG样品经SDS PAGE电泳结果如下 1标准蛋白2猪血清3纯化的IgG样品 19 IgG样品经预处理过程中巯基乙醇的作用而打开二硫键还原成两条单链再进一步与SDS结合成带大量负电荷的SDS 蛋白复合物 SDS PAGE电泳呈现两条较浓的条带猪血清球蛋白经正辛酸法提取 DEAE纯化后所得IgG较纯净基本无其它杂蛋白表明该提取纯化工艺能得到较纯净的免疫球蛋白 20 1 标准曲线制作以标准蛋白质相对分子质量的对数 lgMw 为纵坐标蛋白质迁移距离为横坐标得到以下标准曲线 21 2 IgG样品分子量测定结果根据样品IgG的迁移距离从标准曲线上查出其相对分子质量如下重链约55000 轻链约24000 即猪血清IgG球蛋分子量为16万左右与文献蛋白质技术手册报道结果一致 22 四总结与感想总的来说本次试验还是成功的虽然说试验方法在细节上还有很多需要改进的地方但实验目的已经达到本次实验课是一次不同于以往的自主性实验课程需要我们自己查找资料设计实验方案更需要我们独立思考通过团队合作完成实验 23 这种以学生为主老师为辅的实验课程让我们想得更多学得更多得到的也更多在我们开展讨论的过程中同学们互相学习对实验的设计流程有了深刻的认识实验其间对于细节上的问题我们更加耐心为将来毕业论文的开展提供了有力的基础 24 谢谢

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