基于细胞荧光原位杂交法的人类染色体异常检测试剂-注册技术审查指导原则

附件1基于细胞荧光原位杂交法的人类染色体异常检测试剂注册技术审查指导原则本指导原则旨在指导注册申请人对基于细胞荧光原位杂交法（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH）的人类染色体异常检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。本指导原则是对基于细胞荧光原位杂交法的人类染色体异常检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。一、适用范围本指导原则所述染色体异常的类型包括染色体数目异常、结构异常（包括异位，倒位导致的基因断裂和融合）、扩增、缺失等，例如，产前羊水细胞中的染色体数目异常，白血病患者骨髓细胞中的BCR/ABL基因融合等。检测人类染色体异常的方法有染色体核型分析、原位杂交法、PCR法和高通量测序法等，不同方法在检测染色体异常类型、片段大小、操作要求等方面具有不同特点。本指导原则适用于需进行注册审批方可上市的采用荧光原位杂交法检测人类细胞样本中染色体异常的检测试剂。荧光原位杂交法是指根据碱基互补配对原则，在与目标DNA配对的核酸片段上标记荧光染料（探针），该探针与待检样本中相应的核酸片段在一定条件下特异结合（杂交），形成双链核酸，借助于荧光显微镜观察并记录形成杂交双链的类型、数量和所处染色体区带位置，从而判断待检样本中是否存在染色体异常的检测方法。本指导原则是基于荧光原位杂交法撰写而成，对于显色原位杂交法和银增强原位杂交法等亮视野原位杂交法不适用。本指导原则适用样本类型为人类细胞样本，不适用于在石蜡包埋的细胞学和组织学切片上进行检测的试剂和微生物检测试剂。本文是针对采用荧光原位杂交法检测人类细胞样本中染色体异常的检测试剂的通用指导原则，申请人应结合具体产品的特点进行注册申报。如果申报产品有具体指导原则，应按照执行。本指导原则适用于进行产品注册和相关许可事项变更的产品，包括申报资料中部分项目要求，其他未尽事宜，应当符合体外诊断试剂注册管理办法（国家食品药品监督管理总局令第5号，以下简称办法）等相关法规要求。二、注册申报资料要求注册申报资料的撰写应符合关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告（国家食品药品监督管理总局公告2014年第44号）（以下简称2014年第44号公告）的相关要求。内容主要包括：（一）综述资料1.产品预期用途。描述产品的预期用途，与预期用途相关的临床背景情况。说明检测的位点和靶序列（Target Sequence，TS），包括靶序列的长度、异常类型和特异性信息。说明相关的临床适应症，该异常在适应症中的发生情况和频率，适应症的发生率、适用人群等。说明具体临床意义，例如：是否用于诊断、分型、治疗方案选择、预后判断、微量残留病监测等。介绍相关的临床或实验室诊断方法。2.产品描述。描述产品所采用的技术原理，包括杂交反应和信号结果。描述主要原材料的来源及制备方法，主要生产工艺过程，参考品的制备和确认方法。3.有关生物安全性方面的说明。4.有关产品主要研究结果的总结和评价。5.其他。包括同类产品在国内外批准上市的情况。对同类产品所采用的技术方法、检测位点、样本类型、荧光信号标记及临床应用等进行对比分析，以阐明申请注册产品与国内外同类产品的优势和局限性。对于新研制的体外诊断试剂产品，需要提供被测物与预期临床适应症之间关系的文献资料。（二）主要原材料研究资料应提供主要原材料的来源选择、制备过程、质量分析和质量控制标准等研究资料。如主要原材料为企业自己生产，其生产工艺必须稳定可控；如主要原材料为购自其他供应商，应详述每一原材料的外购方来源，外购方提供的质量标准、出厂检定报告或性能指标证书，以及该原材料到货后的质量检验资料。1.探针：明确探针类型（序列特异性探针、着丝粒探针等），提供该探针序列的选择依据，明确结合位点的序列长度和染色体区带位置，可采用FISH分析结合染色体显带的方法进行定位。如检测位点存在多种异常形式（例如断裂点不同），应合理设计探针避免漏检。探针结合位点的基因组图谱位置应具有特异性，检索基因组数据库，如果发现靶序列与基因组其他区域的序列具有同源性，应进行评估，尽量避免交叉杂交信号的出现。应对探针的浓度、纯度及标记的荧光信号基团进行核实，并进行功能性试验验证其检测性能。探针如为企业自己生产，应描述克隆培养、鉴定、荧光标记和纯化等过程；如为外购，应提供合成机构出具的合成产物的质检证明。2.荧光染料：描述荧光染料的名称和详细特征，例如其最大发射/吸收波长，标记后持续被激发光源照射时的抗淬灭能力等。3.杂交缓冲液：描述配方组成和质量标准，确认其可提供合适的离子和杂交环境。4.背景信号封闭剂：描述采取的降低背景信号的方法，如果采用背景信号封闭剂（例如：人 Cot-1 DNA），应确认其封闭效果。5.细胞核复染剂：一般包含二脒基苯基吲哚（DAPI）和抗褪色剂，用于细胞核DNA的染色，同时防止荧光信号淬灭。描述配方组成和质量标准。6.质控品（如有）：建议试剂盒中包含经验证的质控品，以利于控制FISH试验的质量，对试剂制备和杂交过程进行质控，并可统一结果判读标准，辅助改善实验室间精密度和准确度。质控品可为质控玻片，也可为经固定的细胞悬液。如试剂盒中包含质控品，应详述制备和确认方法。质控品样本来源可为已知结果的临床样本或细胞系，各质控品的结果要求应经过验证，予以明确。7.企业参考品：应包含阳性参考品、阴性参考品、特异性参考品和精密度参考品，详细说明参考品的样本类型、组成、制备和保存情况。参考品应经染色体核型分析或其他合理方法确认其阴阳性。阳性参考品应涵盖主要染色体异常信号类型，阴性参考品主要验证干扰和交叉反应的情况，特异性参考品验证探针杂交位点的特异性，精密度参考品验证产品重复性。阳性参考品、阴性参考品和精密度参考品可采用临床样本或细胞系，特异性参考品应采用处于中期分裂相的正常外周血（或其培养液）淋巴细胞。如产品适用多种样本类型，且各样本类型间存在显著性能差异，需分别设置企业参考品。（三）主要生产工艺及反应体系的研究资料应描述主要生产工艺及确定依据，详述探针标记、工作液配制、检验、分装、包装等工序以及各个步骤的质量关键控制点，可用流程图表示。申请人应建立适当反应体系，以获得准确的检测结果。如果产品涉及样本处理和检测过程的不同方案，应对各方案的一致性予以验证。应对下述内容进行研究，评价指标包括探针信号强度、杂交效率、交叉杂交、非特异性结合及背景强度。1.样本要求1.1样本采集：研究确定样本采集时间（例如特定孕周范围内），最佳/最小采集体积和检测用样本量。如产品适用不同样本类型（例如：羊水细胞、绒毛膜细胞、脐血细胞、骨髓细胞、外周血细胞，新鲜样本或培养样本），应分别予以研究。明确检测的细胞阶段，例如：间期和/或中期。1.2样本固定和制片：应对低渗时间、预固定时间、滴片细胞密度等进行研究。如产品适用不同样本或玻片类型，例如培养和未培养细胞，细胞悬液玻片、细胞涂片和经流式细胞仪分选的细胞玻片，应分别进行研究。1.3 玻片预处理：对预处理条件进行研究，如需蛋白酶消化，应对消化条件进行重点研究，优化蛋白酶的用量和消化时间，尽量减少消化不充分造成的非特异性结合，同时避免消化过强造成DNA损失。如产品适用不同样本或玻片类型，应分别进行研究。2.试剂用量：对探针等各试剂成分的用量进行优化。采用不同用量进行试验，通过平衡全部探针杂交信号强度和非特异信号/背景强度，选取最佳使用量。3.反应条件：杂交过程包括变性（样本和探针DNA单链化）、杂交、洗涤和细胞核复染，过程中的各反应条件对于提高杂交效率，减少交叉杂交至关重要。优化变性温度和时间，杂交温度和时间，研究不同杂交仪或替代仪器的适用性，研究杂交后洗涤条件（主要包括洗涤液组分、洗涤温度和洗涤时间）。试剂盒中包含多种探针时，需对每种探针均进行杂交反应条件优化，最终选择试剂的最佳反应条件。4.计数细胞量：提供结果判读需要计数的细胞量及确定依据。计数细胞量和适用样本类型、预期用途、试剂的杂交效率、精密度、最低检测限等因素有关。（四）分析性能评估资料 申请人应使用多批产品进行研究，建立稳定可靠的性能指标。需提交在产品研制和成品验证阶段对试剂盒进行的所有性能评价的研究资料，包括方案设计、研究方法、材料和设备、试验数据（包括代表性彩色图片）和结果统计分析等详细资料。建议着重对以下性能指标进行研究：1.探针敏感性试剂中探针结合靶序列的能力，也称为杂交效率。可通过研究靶序列被检测到的概率进行评估，例如：分析n个细胞中的2n条染色体，显示各荧光信号的染色体比例应不低于95%，可采用处于中期分裂相的正常外周血（或其培养液）淋巴细胞进行评估。2.探针特异性试剂区分样本中靶序列与其他序列的能力。可通过研究杂交信号是否特异结合到靶序列进行评估，例如：分析n个细胞中的2n条染色体，特异杂交到染色体正确位置的比例应不低于95%，可采用处于中期分裂相的正常外周血（或其培养液）淋巴细胞进行检测，结合显带技术进行观察。如果出现交叉杂交，应考虑靶序列与交叉杂交序列的同源性程度，是否存在其他相似染色体异常类型等问题。应按照下述规则报告交叉杂交的结果：A.在靶序列之外其他位置检测到信号的细胞比例；B.每个细胞/每份样本中不同交叉杂交染色体/区域的数量；C.使用标准系统命名，确定所有交叉杂交的染色体位置，并描述这些非靶序列。3.阴、阳性符合率采用多例已知结果的临床样本进行制片检测。阳性样本应包括靶序列的所有染色体异常类型/信号类型。阴性样本应包括野生型和易混淆异常。阴、阳性样本的检测结果均应在各自的阈值范围内。4.精密度研究试剂在各种条件下，不同染色体异常类型和比例（尤其是医学相关水平附近）的精密度。应对批内和批间差异进行研究，考虑运行内、运行间、日间、人员间、实验室间等因素对检测结果的影响，检测结果应一致或者变异系数（CV）在合理范围内。5.最低检出限试剂检测阳性信号细胞占规定计数细胞的最小百分比。最低检出限与计数细胞总数密切相关，可通过设置不同计数细胞量，确定产品的最低检出限。可采用经合理方法确定阳性细胞比例的不同样本，或采用阴、阳性细胞按不同比例混合的方法，设置多个阳性细胞比例的梯度进行研究。6.干扰物质说明样本中潜在的干扰物质，样本处理和制片过程中的干扰物质，采集过程中可能的其它细胞污染等，研究干扰物质对检测结果的影响。如果产品适用多种样本类型，应进行样本适用性研究，应尽量采用临床样本，分别提供每种样本类型的性能评估资料。（五）阳性判断值确定资料对于此类试剂，阳性判断值即为能够区分染色体异常与否的阈值。应入组已知靶序列异常状态的临床样本，包括阳性、阴性和阳性判断值附近的样本，研究预设阳性判断值，建议采用受试者工作特征曲线（ROC）的分析方法。申请人应采用临床样本对预设阳性判断值进行验证。不同样本类型可能会导致阳性判断值的差异，如果试剂盒适用不同的样本类型，应对所有样本类型的阳性判断值进行验证。如果涉及不同染色体异常类型和/或信号类型，可能需要设置两个或多个阳性判断值，此时应分别进行研究和验证。（六）稳定性研究资料1.试剂稳定性：申请人应充分考虑产品在储存、运输和使用过程中的