酶切若干问题

酶切现象及影响因素详解1 先说一下酶切对象(1) 质粒 要是对质粒进行酶切，那么质粒的纯度挺重要，污染有 DNase 和残留质粒提取中的酚以及高盐对 DNA 酶切都不利，还有 RNA 要去除干净。以上所提的这些这都会影响酶切效果。解决方法 DNase 污染 ：质粒提取的试剂都要进行灭菌，提取时不要拖拉，电泳缓冲液要长换，以免电泳液造成 DNA 降解，电泳液的 pH 不要偏酸，容易降解 DNA.在最后溶解 DNA 时，可以采用 TE 和水，建议用 TE，TE 可以鳌合金属离子，使 DNase 失活。酶切时，TE 也会有一定影响，但你可以将溶解 DNA 时的 TE 少加点。 酶切时，取的 DNA 的体积就可以减少，经水稀释，就问题不了。RNA 的去除：一般将 RNase 加到 TE 中，经过 37 度温育一段时间就可以将 RNA 很好的去除 12个小时就行。酚的污染：首先在用酚仿抽提时，就要小心不要吸到下面的有机溶液，要是为了保险可以再用氯仿单独抽提一下，就可以很好的避免酚的残留。 高盐的去除： 提取质粒时一般盐的浓度很高，若有人在 70乙醇洗盐这步不做，也会影响后面酶切。（2）PCR 产物 PCR 产物经电泳检测是单一目的条带可以直接酶切，若是杂带很多，就要将目的片段回收再酶切。一般在设计引物的时候，会在 5'端引入酶切位点，但是不要忘了在酶切位点外面加几个保护碱基。加入 4 个比较保险，如果没有保护碱基，内切酶是无法切断 DNA 的，即使加入保护碱基，酶切效率也会较低， 需要长时间酶切。（3） 基因组 DNA 将基因组做酶切一般是在 southern blot 时常用，这时酶切体系一般较大，因为基因组中目的基因 的比例是很小的，酶切之后转膜又会有损失，因此多做一点酶切产物，才会获得较好的杂交效果。内切酶也要多加一些，一般都要酶切一夜，才能完全酶切。2 酶切试剂（1）酶切缓冲液：一般公司会给你的说明书中，告诉你用哪种缓冲液，如果是单酶切，按照说明书上提示即可。要是双酶切，原则是先找两种酶有没有可以共用的缓冲液，最好两种酶同时酶切比较省事。实在是两种酶没有共用缓冲液，就得先进行低盐缓冲液酶切，补充适量盐溶液，再行高盐的缓冲液进行酶切 。 （2）限制性内切酶：一般是在20 度保存，吸取时，从冰箱取出后放在冰上进行操作，而且动作要快，防止酶失活。有的人， 将酶分装几管，每次拿出一管来用，可以更好的避免酶失活。国产的内切酶，比如常用的 EcoRI BamHI 还可以，但是其他一些酶质量不如国外的可靠，有时你的酶切若出现 smear 的现象时，总是找不到原因，有可能就是酶中的污染。3 酶切目的 （1）加入多少目的 DNA,这要看你的酶切目的是什么,如果你要是回收目的片段，当然是多一些好，而且在电泳之前要更换电泳液，以免污染。要是只进行酶切鉴定，就可以少加一些目的片段。（2）如果单一的目的片段酶切连接，在 酶切之后要将酶进行加热失活，或者用酚氯仿进行抽提，纯化。（3）要获得不完全酶切的产物，一般都是控制酶切的时间，进行梯度延长酶切，可以获得你所要的最佳酶切时间。4 酶切温度一般常用的内切酶都是在 37 度是最佳的酶切反应温度，也有一些酶是低温活性更好，有的是28 度【酶切问题讨论专栏】 【酶切问题讨论专栏】 如何选择酶切缓冲液，如何提高酶切效率，尤其是 PCR 产物的酶切、双酶切、特殊酶切，总结了以下几点，希望对大家有帮助，欢迎补充！1.PCR 产物的酶切。PCR 产物的酶切与引物上引入的保护碱基有很大的关系，所以设计引物的时候就应该注意到这一点，如何选择保护碱基，具体参见 NEB 网站上关于保护碱基的资料:PCR 产物的酶切相关的帖子：http:/www.dxy.cn/bbs/actions/archie/post/242899_1.htmlhttp:/www.dxy.cn/bbs/post/iew?bid=64&id=818980&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#818980http:/www.dxy.cn/bbs/post/iew?bid=64&id=620693&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#620693http:/www.dxy.cn/bbs/post/iew?bid=64&id=720799&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#7207992.加了保护碱基可能也会遇到切不动的问题，切不动可以从以下方面考虑：（ 1）酶切缓冲液。每种酶都有公司提供的最佳缓冲液，它们的差别只是离子浓度与体系的不同，如 Na、k 、Mg 等，还有 PH 值及缓冲体系（一般 Tris-HCl），另外酶加甘油和 DTT 作为保护剂。在双酶切的时候常会遇到两种酶有各自的缓冲液，要达到高酶切效率，选择是个问题，如果酶切时间和量足够，解决的方法：（A）使用其中一个酶的缓冲液，但要考虑到另一酶的反应效率，反应效率如何，可以查查酶在不同 buffer 里的效率参数，具体见公司网站，如 NEB 提供了很好的 buffer 参数:http:/circuit.neb.com/neb/tech/tech_resource/restriction/buffers/buffer_chart.html。（ B）使用它们的通用的缓冲液，使两种酶在同一缓冲液里达到也足够的酶切效率；没有通用的 BUFFER 怎么办呢？ 分两次酶切。即先用一种酶切，胶回收后再用另一种酶切。一般先低盐后高盐，这种方法保证了在各自的酶切缓冲液中都得到最大的酶切效率，但缺点是要回收，损失大 ；（ C）克隆到 T 载体中，值得推荐的方法，克隆到 T 载体中，不须要考虑受这个条件的限制，酶切位点也可以用 T 载体上自带的。 （2 ）酶切温度。酶切温度也很重要，一般的酶切最适温度为 37 度，有些特殊的酶的反应温度不同，如 Sma 为 30 度。双酶切时这种情况下最好分开切，先低温后高温。（3 ）酶切时间。酶切时间直接影响到酶切是否完全，一般为 1-3h，这个时间已经足够，对于一些活性较好的酶，30min 就可以酶切完全，建议在酶切 1h后取 5ul 跑电泳以鉴定酶切效率； PCR 产物的酶切时间较长，一般过夜。（4）酶失活。如果使用酶解冻后放置太久，可能导致酶失活。这种情况较少见，只能换新酶。如果拿了不同公司的酶，buffer 也不一样，怎么办？放心，可以用不同公司的酶进行双酶切，一般不会有问题的。可以先查查 NEB 的酶在不同缓冲液中的活性百分比，选择它们都有适中活性的 buffer，每个公司生产的酶反应缓冲液针对特定内切酶是最合适的！ (5）酶切体系。选用多大的酶切体系取决于你的样品浓度，在双酶切的时候为了得到质量高的电泳图，尤其插入的是小片段 DNA，酶切后产物量较少，可以增加酶切重组 DNA 的量和增加上样量，建议酶切前测定一下 DNA 浓度或跑电泳看看 DNA 有多浓，做到心中有数。相关帖子http:/www.dxy.cn/bbs/post/iew?bid=64&id=886961&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#886961http:/www.dxy.cn/bbs/post/iew?bid=64&id=458396&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#458396http:/www.dxy.cn/bbs/post/iew?bid=64&id=893847&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#893847关于保护碱基的资料:Cleaage Close to the End of DNA Fragment1.doc (104.5k) wangjun2002274 的工作非常出色，建议加分，值得学习 ! 支持！ 请问前辈：为什么双酶切时要先切低温再切高温？如果酶切过夜会影响酶切效果吗？ 主要是考虑到酶活性的维持。温度对酶的活性影响很大，温度高，容易造成某些酶的失活；双酶切时，由于有 2 种的限制酶存在，2 种酶可能有不同的最适反应温点，当 1 种酶在其最适温点反应时，为了不使另 1 种酶降解或失活，所以双酶切时要先切低温再切高温。 请问 PCR 产物酶切过夜，对连接没影响吗？ 紧急求助！万分感谢！构建 ector 3 个月没结果！我的载体是 PstI 单酶切，脱磷。目的片段是 PCR 产物切胶回收 PstI 单酶切（切 2.5h,引物设计加 6 个保护碱基), ，然后又切胶回收，再连接，阴性对照长一些兰斑（可能脱磷不彻底），但样品只长几个白斑，鉴定全是假的。请问高手问题出在哪？是不是目的片段没切动导致没连上？载体是 pCAMBIA1300, 目的片段 9.7kb。 你的目的片段 9.7kb,有点大, 胶连有点困难了.可以考虑液连.用 Agrose 酶把你的胶溶解.并提高目的片段的纯度和浓度.还有就是你的 PCR 产物 PstI 单酶切的问题,因为你跑胶看不出酶切的效果 .可用一有 PstI 酶切位点的环质做对照一起酶切,可以看出部分问题.你的载体脱磷也确实是个麻烦,每次做阴性对照也很对,但脱磷的程度要看你自己的掌握了,脱磷不彻底和太过了也不好.不过,CIP 一定要保证活性.最好用新的. 非常谢谢 biotin, 我再试试。 我个人认为，一般不到万不得已，没必要先回收再酶切，损失太大，绝大多数双酶切可在 1×通用 buffer 中先切 1 小时，再在 2×通用 buffer 中切 1 小时，可解决绝大多数酶切问题。 不过先回收，也能保证酶切的效率，如果 PCR 的产物量满意的话，回收的损失可以忽略不计。毕竟酶切的效率对于克隆化相对更重要一些。 过去，早期的内切酶有星活性，过度酶切能给产物切的七零八落，现在好像已经没有这个问题了，早些年曾经遇到过把产物切碎了的情况。 是不是引物上加酶切位点的才需要保护碱基？我的酶切位点都在 PCR 产物内部包含，还需要在引物上加保护碱基么？ 不需要的，连接到 T 载体上直接就可以酶切鉴定！ 我的 PCR 产物的酶切位点 XbaI 的保护性碱基是 CG,HbaI 也是 CG，会影响我的酶切吗，我十分担心，高手能指点一下吗 我的质粒是 pcdna3.1+cfp-c1 , 6000 多 bp！有一个 not1 的酶切位点，我酶切了很多次都没有成功？酶切都是 2 条带。我用 50ul 体系，加了 15ul 的质粒（100ng/ul）， 2ul 的酶，发应了 10 个小时还没有切动。请高手指点，谢谢了！wangjun2002274 wrote:不需要的，连接到 T 载体上直接就可以酶切鉴定！:)谢谢，小女子初涉江湖很多问题不懂，在这里可以学得到很多好东东，谢谢！ 我现在双酶切一个 T 载体连接产物 ,用的是和 EcoRI,先用 BamHI30 度切 5 小时,之后沉淀线性 DNA,方法是:加入 1/10 体积的乙酸钠和风细雨 2.5 体积的无水乙醇,18000 转 15 分钟离心,再加入 70%乙醇 15000 转离心 10 分钟,最后等乙醇挥发干净了再加入 EcoRI 的酶切体系 37 度切 5 小时.可是结果总是不对.本应该是2000 和 3000 两条带,可是总是出现不正确的带,或者根本就乱七八糟,怎么回事啊? 请大家 帮帮忙! 另外我还要双酶切 pcDNA3.1,但是因为也是用的 BamHI 和 EcoRI,所以切下来与没切开的片段相差只有几十 bp,电泳根本看不出来,那我如何才能判断出来到底有没有切下来呢 ?难道只能等连接上了才知道吗? 1）你首先要确定片段是否已经连接到 T 载体上；EcoR I 和 BamH I 有共有的buffer，就用 BamH I 的自带 buffer 试一下。2）确定 BamH I 和 EcoR I 的酶切效率，你可以找一个其它的单酶切位点，和BamH I 或 EcoR I 双酶切，注意切下来的片段最好能达到 400bp