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酶切若干问题

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  • 卖家[上传人]:油条
  • 文档编号:10880197
  • 上传时间:2017-10-11
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    • 1、酶切现象及影响因素详解1 先说一下酶切对象(1) 质粒 要是对质粒进行酶切,那么质粒的纯度挺重要,污染有 DNase 和残留质粒提取中的酚以及高盐对 DNA 酶切都不利,还有 RNA 要去除干净。以上所提的这些这都会影响酶切效果。解决方法 DNase 污染 :质粒提取的试剂都要进行灭菌,提取时不要拖拉,电泳缓冲液要长换,以免电泳液造成 DNA 降解,电泳液的 pH 不要偏酸,容易降解 DNA.在最后溶解 DNA 时,可以采用 TE 和水,建议用 TE,TE 可以鳌合金属离子,使 DNase 失活。酶切时,TE 也会有一定影响,但你可以将溶解 DNA 时的 TE 少加点。 酶切时,取的 DNA 的体积就可以减少,经水稀释,就问题不了。RNA 的去除:一般将 RNase 加到 TE 中,经过 37 度温育一段时间就可以将 RNA 很好的去除 12个小时就行。酚的污染:首先在用酚仿抽提时,就要小心不要吸到下面的有机溶液,要是为了保险可以再用氯仿单独抽提一下,就可以很好的避免酚的残留。 高盐的去除: 提取质粒时一般盐的浓度很高,若有人在 70乙醇洗盐这步不做,也会影响后面酶切。(2)PCR 产

      2、物 PCR 产物经电泳检测是单一目的条带可以直接酶切,若是杂带很多,就要将目的片段回收再酶切。一般在设计引物的时候,会在 5端引入酶切位点,但是不要忘了在酶切位点外面加几个保护碱基。加入 4 个比较保险,如果没有保护碱基,内切酶是无法切断 DNA 的,即使加入保护碱基,酶切效率也会较低, 需要长时间酶切。(3) 基因组 DNA 将基因组做酶切一般是在 southern blot 时常用,这时酶切体系一般较大,因为基因组中目的基因 的比例是很小的,酶切之后转膜又会有损失,因此多做一点酶切产物,才会获得较好的杂交效果。内切酶也要多加一些,一般都要酶切一夜,才能完全酶切。2 酶切试剂(1)酶切缓冲液:一般公司会给你的说明书中,告诉你用哪种缓冲液,如果是单酶切,按照说明书上提示即可。要是双酶切,原则是先找两种酶有没有可以共用的缓冲液,最好两种酶同时酶切比较省事。实在是两种酶没有共用缓冲液,就得先进行低盐缓冲液酶切,补充适量盐溶液,再行高盐的缓冲液进行酶切 。 (2)限制性内切酶:一般是在20 度保存,吸取时,从冰箱取出后放在冰上进行操作,而且动作要快,防止酶失活。有的人, 将酶分装几管,每次拿

      3、出一管来用,可以更好的避免酶失活。国产的内切酶,比如常用的 EcoRI BamHI 还可以,但是其他一些酶质量不如国外的可靠,有时你的酶切若出现 smear 的现象时,总是找不到原因,有可能就是酶中的污染。3 酶切目的 (1)加入多少目的 DNA,这要看你的酶切目的是什么,如果你要是回收目的片段,当然是多一些好,而且在电泳之前要更换电泳液,以免污染。要是只进行酶切鉴定,就可以少加一些目的片段。(2)如果单一的目的片段酶切连接,在 酶切之后要将酶进行加热失活,或者用酚氯仿进行抽提,纯化。(3)要获得不完全酶切的产物,一般都是控制酶切的时间,进行梯度延长酶切,可以获得你所要的最佳酶切时间。4 酶切温度一般常用的内切酶都是在 37 度是最佳的酶切反应温度,也有一些酶是低温活性更好,有的是28 度【酶切问题讨论专栏】 【酶切问题讨论专栏】 如何选择酶切缓冲液,如何提高酶切效率,尤其是 PCR 产物的酶切、双酶切、特殊酶切,总结了以下几点,希望对大家有帮助,欢迎补充!1.PCR 产物的酶切。PCR 产物的酶切与引物上引入的保护碱基有很大的关系,所以设计引物的时候就应该注意到这一点,如何选择保护碱

      4、基,具体参见 NEB 网站上关于保护碱基的资料:PCR 产物的酶切相关的帖子:http:/ 1)酶切缓冲液。每种酶都有公司提供的最佳缓冲液,它们的差别只是离子浓度与体系的不同,如 Na、k 、Mg 等,还有 PH 值及缓冲体系(一般 Tris-HCl),另外酶加甘油和 DTT 作为保护剂。在双酶切的时候常会遇到两种酶有各自的缓冲液,要达到高酶切效率,选择是个问题,如果酶切时间和量足够,解决的方法:(A)使用其中一个酶的缓冲液,但要考虑到另一酶的反应效率,反应效率如何,可以查查酶在不同 buffer 里的效率参数,具体见公司网站,如 NEB 提供了很好的 buffer 参数:http:/ B)使用它们的通用的缓冲液,使两种酶在同一缓冲液里达到也足够的酶切效率;没有通用的 BUFFER 怎么办呢? 分两次酶切。即先用一种酶切,胶回收后再用另一种酶切。一般先低盐后高盐,这种方法保证了在各自的酶切缓冲液中都得到最大的酶切效率,但缺点是要回收,损失大 ;( C)克隆到 T 载体中,值得推荐的方法,克隆到 T 载体中,不须要考虑受这个条件的限制,酶切位点也可以用 T 载体上自带的。 (2 )酶切温

      5、度。酶切温度也很重要,一般的酶切最适温度为 37 度,有些特殊的酶的反应温度不同,如 Sma 为 30 度。双酶切时这种情况下最好分开切,先低温后高温。(3 )酶切时间。酶切时间直接影响到酶切是否完全,一般为 1-3h,这个时间已经足够,对于一些活性较好的酶,30min 就可以酶切完全,建议在酶切 1h后取 5ul 跑电泳以鉴定酶切效率; PCR 产物的酶切时间较长,一般过夜。(4)酶失活。如果使用酶解冻后放置太久,可能导致酶失活。这种情况较少见,只能换新酶。如果拿了不同公司的酶,buffer 也不一样,怎么办?放心,可以用不同公司的酶进行双酶切,一般不会有问题的。可以先查查 NEB 的酶在不同缓冲液中的活性百分比,选择它们都有适中活性的 buffer,每个公司生产的酶反应缓冲液针对特定内切酶是最合适的! (5)酶切体系。选用多大的酶切体系取决于你的样品浓度,在双酶切的时候为了得到质量高的电泳图,尤其插入的是小片段 DNA,酶切后产物量较少,可以增加酶切重组 DNA 的量和增加上样量,建议酶切前测定一下 DNA 浓度或跑电泳看看 DNA 有多浓,做到心中有数。相关帖子http:/ Cl

      6、ose to the End of DNA Fragment1.doc (104.5k) wangjun2002274 的工作非常出色,建议加分,值得学习 ! 支持! 请问前辈:为什么双酶切时要先切低温再切高温?如果酶切过夜会影响酶切效果吗? 主要是考虑到酶活性的维持。温度对酶的活性影响很大,温度高,容易造成某些酶的失活;双酶切时,由于有 2 种的限制酶存在,2 种酶可能有不同的最适反应温点,当 1 种酶在其最适温点反应时,为了不使另 1 种酶降解或失活,所以双酶切时要先切低温再切高温。 请问 PCR 产物酶切过夜,对连接没影响吗? 紧急求助!万分感谢!构建 ector 3 个月没结果!我的载体是 PstI 单酶切,脱磷。目的片段是 PCR 产物切胶回收 PstI 单酶切(切 2.5h,引物设计加 6 个保护碱基), ,然后又切胶回收,再连接,阴性对照长一些兰斑(可能脱磷不彻底),但样品只长几个白斑,鉴定全是假的。请问高手问题出在哪?是不是目的片段没切动导致没连上?载体是 pCAMBIA1300, 目的片段 9.7kb。 你的目的片段 9.7kb,有点大, 胶连有点困难了.可以考虑液连

      7、.用 Agrose 酶把你的胶溶解.并提高目的片段的纯度和浓度.还有就是你的 PCR 产物 PstI 单酶切的问题,因为你跑胶看不出酶切的效果 .可用一有 PstI 酶切位点的环质做对照一起酶切,可以看出部分问题.你的载体脱磷也确实是个麻烦,每次做阴性对照也很对,但脱磷的程度要看你自己的掌握了,脱磷不彻底和太过了也不好.不过,CIP 一定要保证活性.最好用新的. 非常谢谢 biotin, 我再试试。 我个人认为,一般不到万不得已,没必要先回收再酶切,损失太大,绝大多数双酶切可在 1通用 buffer 中先切 1 小时,再在 2通用 buffer 中切 1 小时,可解决绝大多数酶切问题。 不过先回收,也能保证酶切的效率,如果 PCR 的产物量满意的话,回收的损失可以忽略不计。毕竟酶切的效率对于克隆化相对更重要一些。 过去,早期的内切酶有星活性,过度酶切能给产物切的七零八落,现在好像已经没有这个问题了,早些年曾经遇到过把产物切碎了的情况。 是不是引物上加酶切位点的才需要保护碱基?我的酶切位点都在 PCR 产物内部包含,还需要在引物上加保护碱基么? 不需要的,连接到 T 载体上直接就可以酶切

      8、鉴定! 我的 PCR 产物的酶切位点 XbaI 的保护性碱基是 CG,HbaI 也是 CG,会影响我的酶切吗,我十分担心,高手能指点一下吗 我的质粒是 pcdna3.1+cfp-c1 , 6000 多 bp!有一个 not1 的酶切位点,我酶切了很多次都没有成功?酶切都是 2 条带。我用 50ul 体系,加了 15ul 的质粒(100ng/ul), 2ul 的酶,发应了 10 个小时还没有切动。请高手指点,谢谢了!wangjun2002274 wrote:不需要的,连接到 T 载体上直接就可以酶切鉴定!:)谢谢,小女子初涉江湖很多问题不懂,在这里可以学得到很多好东东,谢谢! 我现在双酶切一个 T 载体连接产物 ,用的是和 EcoRI,先用 BamHI30 度切 5 小时,之后沉淀线性 DNA,方法是:加入 1/10 体积的乙酸钠和风细雨 2.5 体积的无水乙醇,18000 转 15 分钟离心,再加入 70%乙醇 15000 转离心 10 分钟,最后等乙醇挥发干净了再加入 EcoRI 的酶切体系 37 度切 5 小时.可是结果总是不对.本应该是2000 和 3000 两条带,可是总是出现不正确的带,或者根本就乱七八糟,怎么回事啊? 请大家 帮帮忙! 另外我还要双酶切 pcDNA3.1,但是因为也是用的 BamHI 和 EcoRI,所以切下来与没切开的片段相差只有几十 bp,电泳根本看不出来,那我如何才能判断出来到底有没有切下来呢 ?难道只能等连接上了才知道吗? 1)你首先要确定片段是否已经连接到 T 载体上;EcoR I 和 BamH I 有共有的buffer,就用 BamH I 的自带 buffer 试一下。2)确定 BamH I 和 EcoR I 的酶切效率,你可以找一个其它的单酶切位点,和BamH I 或 EcoR I 双酶切,注意切下来的片段最好能达到 400bp

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