酶切若干问题
24页1、酶切现象及影响因素详解1 先说一下酶切对象(1) 质粒 要是对质粒进行酶切,那么质粒的纯度挺重要,污染有 DNase 和残留质粒提取中的酚以及高盐对 DNA 酶切都不利,还有 RNA 要去除干净。以上所提的这些这都会影响酶切效果。解决方法 DNase 污染 :质粒提取的试剂都要进行灭菌,提取时不要拖拉,电泳缓冲液要长换,以免电泳液造成 DNA 降解,电泳液的 pH 不要偏酸,容易降解 DNA.在最后溶解 DNA 时,可以采用 TE 和水,建议用 TE,TE 可以鳌合金属离子,使 DNase 失活。酶切时,TE 也会有一定影响,但你可以将溶解 DNA 时的 TE 少加点。 酶切时,取的 DNA 的体积就可以减少,经水稀释,就问题不了。RNA 的去除:一般将 RNase 加到 TE 中,经过 37 度温育一段时间就可以将 RNA 很好的去除 12个小时就行。酚的污染:首先在用酚仿抽提时,就要小心不要吸到下面的有机溶液,要是为了保险可以再用氯仿单独抽提一下,就可以很好的避免酚的残留。 高盐的去除: 提取质粒时一般盐的浓度很高,若有人在 70乙醇洗盐这步不做,也会影响后面酶切。(2)PCR 产
2、物 PCR 产物经电泳检测是单一目的条带可以直接酶切,若是杂带很多,就要将目的片段回收再酶切。一般在设计引物的时候,会在 5端引入酶切位点,但是不要忘了在酶切位点外面加几个保护碱基。加入 4 个比较保险,如果没有保护碱基,内切酶是无法切断 DNA 的,即使加入保护碱基,酶切效率也会较低, 需要长时间酶切。(3) 基因组 DNA 将基因组做酶切一般是在 southern blot 时常用,这时酶切体系一般较大,因为基因组中目的基因 的比例是很小的,酶切之后转膜又会有损失,因此多做一点酶切产物,才会获得较好的杂交效果。内切酶也要多加一些,一般都要酶切一夜,才能完全酶切。2 酶切试剂(1)酶切缓冲液:一般公司会给你的说明书中,告诉你用哪种缓冲液,如果是单酶切,按照说明书上提示即可。要是双酶切,原则是先找两种酶有没有可以共用的缓冲液,最好两种酶同时酶切比较省事。实在是两种酶没有共用缓冲液,就得先进行低盐缓冲液酶切,补充适量盐溶液,再行高盐的缓冲液进行酶切 。 (2)限制性内切酶:一般是在20 度保存,吸取时,从冰箱取出后放在冰上进行操作,而且动作要快,防止酶失活。有的人, 将酶分装几管,每次拿
3、出一管来用,可以更好的避免酶失活。国产的内切酶,比如常用的 EcoRI BamHI 还可以,但是其他一些酶质量不如国外的可靠,有时你的酶切若出现 smear 的现象时,总是找不到原因,有可能就是酶中的污染。3 酶切目的 (1)加入多少目的 DNA,这要看你的酶切目的是什么,如果你要是回收目的片段,当然是多一些好,而且在电泳之前要更换电泳液,以免污染。要是只进行酶切鉴定,就可以少加一些目的片段。(2)如果单一的目的片段酶切连接,在 酶切之后要将酶进行加热失活,或者用酚氯仿进行抽提,纯化。(3)要获得不完全酶切的产物,一般都是控制酶切的时间,进行梯度延长酶切,可以获得你所要的最佳酶切时间。4 酶切温度一般常用的内切酶都是在 37 度是最佳的酶切反应温度,也有一些酶是低温活性更好,有的是28 度【酶切问题讨论专栏】 【酶切问题讨论专栏】 如何选择酶切缓冲液,如何提高酶切效率,尤其是 PCR 产物的酶切、双酶切、特殊酶切,总结了以下几点,希望对大家有帮助,欢迎补充!1.PCR 产物的酶切。PCR 产物的酶切与引物上引入的保护碱基有很大的关系,所以设计引物的时候就应该注意到这一点,如何选择保护碱
4、基,具体参见 NEB 网站上关于保护碱基的资料:PCR 产物的酶切相关的帖子:http:/ 1)酶切缓冲液。每种酶都有公司提供的最佳缓冲液,它们的差别只是离子浓度与体系的不同,如 Na、k 、Mg 等,还有 PH 值及缓冲体系(一般 Tris-HCl),另外酶加甘油和 DTT 作为保护剂。在双酶切的时候常会遇到两种酶有各自的缓冲液,要达到高酶切效率,选择是个问题,如果酶切时间和量足够,解决的方法:(A)使用其中一个酶的缓冲液,但要考虑到另一酶的反应效率,反应效率如何,可以查查酶在不同 buffer 里的效率参数,具体见公司网站,如 NEB 提供了很好的 buffer 参数:http:/ B)使用它们的通用的缓冲液,使两种酶在同一缓冲液里达到也足够的酶切效率;没有通用的 BUFFER 怎么办呢? 分两次酶切。即先用一种酶切,胶回收后再用另一种酶切。一般先低盐后高盐,这种方法保证了在各自的酶切缓冲液中都得到最大的酶切效率,但缺点是要回收,损失大 ;( C)克隆到 T 载体中,值得推荐的方法,克隆到 T 载体中,不须要考虑受这个条件的限制,酶切位点也可以用 T 载体上自带的。 (2 )酶切温
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