磁性纳米颗粒固定化酶研究

华中科技大学 硕士学位论文 磁性纳米颗粒固定化酶研究 姓名：黄平英 申请学位级别：硕士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：赵元弟 2011-01-20 I 华华 中 科中 科 技技 大 学 硕 士 学 位 论大 学 硕 士 学 位 论 文文 摘 要 摘 要 酶是一类具有催化功能的生物大分子，广泛存在于自然界中。酶催化反应具有 反应条件温和（生理 pH 和温度） 、易降解、催化效率高及专一性强等特点，但游离 的酶稳定性差且不能回收利用，所以近几十年来关于各种固定化酶技术和各种载体 材料的研究应运而生。固定化酶的原理是指通过一定的方法将酶固定在一定的载体 上并使其在一定空间范围内进行催化作用。 与传统的材料相比，磁性纳米颗粒是一种新型的复合材料，具有其独特的性质， 超顺磁性及良好的生物相容性，使其在生物、医药和环保领域有着广泛的应用。用 磁性纳米颗粒为载体固定化酶，可实现在外加磁场下快捷的与产物分离，使工业化 连续化生产成为可能，且分离比较彻底，简化了后续的产物分离过程；磁性纳米颗 粒比表面积大，结合位点多，固载量大，因此磁性纳米颗粒作为载体固定化酶的研 究成为生物催化领域的热点。 本文介绍了以磁性纳米颗粒为载体，采用不同的固定化方法制备固定化酶。首 先用化学共沉淀法合成水溶性的磁性 Fe3O4纳米颗粒， 以此为载体用包埋法制备磁性 海藻酸钙微球固定化脂肪酶，并考察了影响固定化酶水解活性的一系列因素；然后 尝试用不同的方法在磁性 Fe3O4纳米颗粒上修饰上氨基， 以此为载体用共价结合法制 备固定化碱性蛋白酶；最后选取一种稳定性比较好的固定化酶应用于微波中催化生 物反应。 关键词关键词：酶 固定化 磁性纳米颗粒 微波 II 华华 中 科中 科 技技 大 学 硕 士 学 位 论大 学 硕 士 学 位 论 文文 Abstract Enzyme is a kind of biological macromolecules with catalytic ability and is widely found in nature. Catalysis by enzyme has been proved to offer lots of special features, such as mild reaction conditions (biological pH and temperature), biodegradation, high catalytic efficiency and strong specificity. During the past few decades, study on the immobilization technology and enzyme carriers has attracted a lot of researchers attention, because the free enzyme is unstable and can not be reused and recycled. The principle of immobilized enzyme is to immobilize the enzyme onto a special carrier to keep it in a defined space through some processes and the enzyme can still retain the catalytic ability. Magnetic nanoparticles have been widely applied in biology, medicine and environment fields due to their unique superparamagnetism and good biocompatibility. Enzyme immobilized onto magnetic nanoparticles can be separated from the solution quickly under an external magnetic field. Another advantage of magnetic nanoparticles as enzyme carriers is their large surface area and thus can provide more binding sites for enzyme immobilization. In this paper, enzyme immobilization on magnetic nanoparticles in different methods was investigated. For the first method, water-soluble magnetic Fe3O4 nanoparticles were firstly synthesized by a co-precipitation method. Then lipase and magnetic nanoparticles were co-entrapped in calcium alginate capsules and several factors affecting the enzyme recovery activities were studied. For the second method, magnetic Fe3O4 nanoparticles were modified with amino silane in ethanol and acetone respectively to produce amino groups on the surface. Then alkaline protease was covalently coupled to these amino-modified magnetic nanoparticles. Comparing their reproducibility and operational stability, the immobilized enzyme with good performance was chosen for biocatalysis in the microwave. Keywords: enzyme immobilization magnetic nanoparticles microwave 独创性声明独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人或集体，均已在 文中以明确方式标明。本人完全意识到，本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密，在_年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密。 (请在以上方框内打“”) 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 1 华华 中 科中 科 技技 大 学 硕 士 学 位 论大 学 硕 士 学 位 论 文文 1 绪论 绪论 酶是一类具有催化功能的生物大分子，存在于各种动物、植物、微生物细胞中， 按照其化学组成可分为蛋白类酶和核酸类酶。蛋白类酶按照其催化作用的类型又可 分为氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和合成酶六大类。跟传统的催 化剂相比，酶具有作用条件温和（生理pH和温度） 、易降解，对环境污染少、催化效 率高、专一性强等特点1，在食品加工、化工生产、医药行业、环保及能源等领域广 泛应用。但是游离的酶在使用的过程中也发现了很多不足2：游离酶的稳定性差， 除了一些特殊的耐高温和耐酸碱的酶外，其他大多数酶在高温、强酸、强碱及重金 属等外界因素的影响下都很容易失活；酶的催化反应一般都在溶液中进行的，反 应结束后，与底物和产物混合在一起，尽管还有很高的酶活力，回收利用也很困难， 这样造成生产成本提高且难以实现连续化生产；催化反应结束后，产物和其他杂 质混合在一起，进一步分离纯化较困难。为此，人们针对酶的不足寻求不同的改善 方法，其中，酶的固定化技术是重要手段之一。 1.1 固定化酶 1.1 固定化酶 1.1.1 固定化酶概述固定化酶概述 固定化酶是指固定在一定的载体上并能在一定空间范围内进行催化作用的酶。 对于固定化酶的研究是从20世纪50年代开始的， 1953年德国格鲁布霍费 （Glubhofer） 和施莱思（Schleith）经重氮法活化载体聚苯乙烯树脂后，分别与羧肽酶、淀粉酶、 胃蛋白酶、核糖核酸酶结合，制成固定化酶；到 20 世纪 60 年代后期，有关固定化 技术的研究迅速发展；日本科学家千烟一郎在 1969 年首次将固定化氨基酰化酶应用 于工业生产规模，催化 DL-氨基酸连续生产 L-氨基酸，实现了酶在应用史上的变革， 此后，固定化技术作为酶工程的核心技术迅速发展，使酶工程作为一个独立的学科 从发酵工程中脱颖出来 2。关于固定化酶的名称，曾有过固相酶、水不溶酶、固定 2 华华 中 科中 科 技技 大 学 硕 士 学 位 论大 学 硕 士 学 位 论 文文 酶等多种表达方式，但都不能确切的表达。在 1970 年召开的第一次国际酶工程学术 会议，确定固定化酶的统一英文名称为固定化酶（immobilized enzyme）3。 与游离的酶相比，固定化酶具有很多优点1：方便操作，易于从产物中分离， 消除对产物中蛋白的破坏；简化产物的提纯工艺；使酶能够有效回收和重复利 用，实现连续化反应以降低生产成本；增加酶在特殊环境如高温或有机环境中的 稳定性，包括操作稳定性和储存稳定性；可实现酶在非水相中的催化； 与游离 酶相比更容易制备多酶体系，及进行连续化酶反应。 固定化酶技术已应用于医药行业、食品行业、精细化学品和污水处理等领域， 尤其是生物催化行业中广泛应用。酶催化反应，反应条件温和，且反应后易于降解， 对环境污染小，对人类环保有着重要的意义，所以对酶的固定化技术研究及应用会 越来越受关注。 1.1.2 固定化酶方法固定化酶方法 传统的固定化酶的方法主要有三类4：包埋法（微囊化法） 、基于载体固定化法、 交联法。基于载体的固定化方法又包括物理吸附、离子结合、化学结合。图1-1是四 种传统的固定化方法。 图 1-1 固定化酶技术4：包埋（A）,微囊化（B） ，载体固定（C）,交联（D）. Fig.1-1Enzyme immobilization strategies4: entrapment (A), encapsulation (B), solid support (C) and self immobilization (D). Enzymes are represented by circles 1.1.2.1 包埋法（微囊化法） 酶的微囊化固定法是指将酶（包括水溶性的酶、冻干的酶、或具有催化作用的 整个细胞）通过物理或化学方法包封在半透性高分子膜内的方法5。 微囊化囊膜的孔 3 华华 中 科中 科 技技 大 学 硕 士 学 位 论大 学 硕 士 学 位 论 文文 径能够让底物和产物分子自由通过，而酶分子不能透过，这样将酶分子包封在囊膜 中，底物分子能透过囊膜分子进入微囊