Nrf2ARE通路在大鼠脊髓损伤后的神经保护作用.pdf

南京大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下独立进行的研究工作所取得的成果尽我所知，除了文中特别加以标注引用的内容外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示了谢意研究生签名：壬炀日期：渺1 ，≥州印阳南京大学学位论文使用授权声明本学位论文作者同意学校保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存论文本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容论文的公布( 包括刊登) 授权南京大学研究生院办理研究生签名：主殳角⋯名：2 协岛⋯川咖叱目前言脊髓损伤( s p i n a lc o r di n j u r y ，S C I ) 是临床常见的疾病且常导致终身残疾目前，临床对于发生于8 小时内的S C I 常规处理是采用激素冲击治疗，但其改善S C I 的效果并不明显且饱含争议，同时还伴有严重的并发症S C I 主要分为两个病理过程：原发性损伤和继发性损伤，其中原发性损伤为S C I 发生时产生的物理性损伤，无法人为干预；继发性损伤是由原发性损伤诱导的，损伤范围由损伤中心向两侧扩散，且损伤范围远大于原发性损伤灶。

继发性损伤具有可逆性，是治疗S C I 的关键切入点核因子E 2 相关因子2 一抗氧化反应元件( n u c l e a rf a c t o rE 2 - r e l a t e df a c t o r2a n t i o x i d a n tr e s p o n s ee l e m e n t ，N r f 2 一A R E ) 通路能够调控一大批细胞保护因子的基因表达，如抗氧化和抗炎症的因子等，涉及中枢神经系统继发性损伤的多种机制前期研究已证实N r f 2 - A R E 通路在颅脑外伤后对脑组织具有神经保护作用．但在S C I 呻' 尚未有报道，因此我们设计了此课题本课题通过建立大鼠胸段( T 8 ) 中度S C I 模型以及可控性细胞损伤模型，着重探讨以下内容：1 ．大鼠S C I 后N r f 2 一A R E 在脊髓组织的表达与激活，以及使用激动剂莱菔硫烷后N r f 2 - A R E 通路对脊髓组织的神经保护作用2 ．N r f 2 - A R E 在神经元中抑制炎症的保护作用，以及提出N m 与N F —K B ：之- N 新的相互作用机制3 ．N r f 2 - A R E 通路在多种神经细胞如神经元、星形细胞和小胶质细胞损伤后的表达及激活。

—2 0 0 —8 圣A ．博士生姓名：指导教师( 姓名、职称》至婆峦熬撞第一章绪论本章旨在介绍本论文相关研究背景，包括脊髓损伤；K e a p l —N r f 2 - A R E 的结构及激活模式；N r f 2 的神经保护作用；N r f 2 与N F —K B 之间的相互关系以及莱菔硫烷的药代动力学I I第二章N r f 2 - A R E 通路激活对大鼠脊髓损伤的神经保护作用脊髓损伤( s p i n a lc o r di n j u r y ，S C I ) 继发性损伤常导致氧化应激损伤、炎症反应、线粒体功能丧失的产生，最终导致细胞死亡核因子E 2 相关因子2 一抗氧化反应元件( n u c l e a rf a c t o rE 2 一r e l a t e df a c t o r2a n t i o x i d a n tr e s p o n s ee l e m e n t ，N r f 2 - A R E ) 通路能有效地调节上述继发性损伤机制因此，在本研究中我们探讨N r f 2 - A R E 通路激活是否对大鼠脊髓损伤具有神经保护作用使用N Y u 冲击仪制得雌·】：g F i s c h e r 大鼠胸段( T 8 ) 脊髓中度损伤模型。

损伤后，N r f 2 蛋白在脊髓组织多种神经细胞( 神经元、星形细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞) 细胞质内活化、积聚并逐渐向细胞核内转移，并启动A R E 调控的保护因子如血红素加氧酶1( h e m eo x y g e n a s e l ，H O 一1 ) 和谷氨酸半胱氨酸链接酶催化亚单位( g l u t a m a t e - c y s t e i n el i g a s ec a t a l y t i cs u b u n i t ，G C L C ) 的表达莱菔硫烷( S u l f o r a p h a n e ，S F N ) 作为N r f 2 一A R E 通路激动剂能有效地提高大鼠脊髓组织中N r f 2 盔[ G C L C 的含量，同时抑制核因子K B ( n u c l e a rf a c t o r - - K B ，N F —K B ) 的活化以及降低炎症因子如白介素1 p ( i n t e r l e u k i n 一1 p ，I L - I p ) 和肿瘤坏死因子0 c ( t u m o rn e c r o s i sf a c t o r - - a ，T N F —C c ) 的表达，最终减少脊髓损伤体积并改善大鼠运动协调性。

这些结果表明，N r f 2 一A R E 的激活对大鼠脊髓损伤具有神经保护作用，同时S F N 也可作为治疗脊髓损伤的神经保护药物I I I第三章S F N 抑制A T P 诱导的N F - _ ：B 激活的作用第二章实验研究已经证实，莱菔硫烷( s u l f o r a p h a n e ，S F N ) 可以有效地提高大鼠损伤脊髓组织中核因子E 2 相关因子2 ( n u c l e a rf a c t o rE 2 一r e l a t e df a c t o r2 ，N r f 2 ) 及下游保护因子的表达，同时抑制核因子K B ( n u c l e a rf a c t o r - - K B ，N F —K B )的激活及下游炎症因子的表达，最终改善大鼠运动功能然而，N r f 2 与N F —K B之间具体的作用机制尚未明确．本章节实验旨在使用原代大鼠神经元培养，明确N r f 2 的抗炎作用及N r f 2 与N F - K ：B 具体相互作用机制原代大鼠神经元使用不同浓度S F N ( 0 、1 0 - t M 和2 0 v t M ) 预处理2 小时，随后加入1 m MA T P 诱导N F —K B 通路的激活。

使用蛋白免疫印迹法检测N m 及下游因子、炎症因子和p h o s p h o —I K B ( x的含量结果显示，S F N 呈浓度依赖性的提高大鼠神经元中N m 及下游保护因子的含量，同时抑制细胞中A T P 诱导的C a s p a s e 一1 、白介素1 p ( I n t e l u e k i n - l [ 3 ，I L 一1 p )及肿瘤坏死因子Q ( t u m o rn e c r o s i sf a c t o rC 【，T N F —Q ) 的表达；另外，I I ：B a 的磷酸化程度及I L - 1 p 前体( p r o —I L - I p ) 表达也被明显抑制，提示A T P 诱导的N F —K B通路被S F N 抑制综上所述，S F N 不仅能上调大鼠神经元内N r f 2 及下游保护因子的表达，同时抑制A T P 诱导的N F —K B 活化及下游因子表达本实验揭示了N m 与N F —K B 之间复杂的相互作用中一种新的作用机制I V第四章N r f 2 - A R E 在神经元、星形细胞和小胶质细胞损伤后的表达在第二章中，激光共聚焦方法已经证实在大鼠脊髓损伤1 天后，核因子E 2 相关因子2 ( n u c l e a rf a c t o rE 2 一r e l a t e df a c t o r2 ，N r f 2 ) 能在脊髓前角区域内的神经元、星形细胞、少突胶质细胞以及小胶质细胞中激活．但是，N r f 2 一A R E 在各种细胞损伤后的表达情况目前还没有研究。

在本章中，使用可控性的细胞损伤仪对各种神经细胞进行损伤，然后使用蛋白免疫印迹法测定N r f 2 及下游因子在细胞损伤后的蛋白水平，明确N r f 2 一A R E 通路在各种神经细胞损伤后的表达情况在神经元中，N r f 2 一A R E 通路在损伤后1 5 分钟即被激活在星形细胞中，N r f 2 蛋白水平在损伤后随时间推移而逐渐降低，下游因子蛋白水平也未见升高；在小胶质细胞中，N f f 2 激活在细胞损伤后1 小时出现，晚于在神经元中的激活．这些结果表明，N r f 2 - A R E 通路在各种神经细胞损伤后的表达各不相同，提示各种神经细胞在组织中的功能及作用各不相同各种细胞类型畔' N f f 2 - A R E 具体的神经保护机制以及各种细胞之间的相互作用值得进一步研究VT H E S I S ：N e u r o p r o t e c t i o no fN r f 2 - A R Ea c t i v a t i o nf o l l o w i n gs p i n a lc o r di n j u r yi nr a t sS P E C I A L I Z A T I O N ：S u r g e r y ( N e u r o s u r g e r y )P O S T G R A D U A T E ：X i a o l i a n gW a n gM E N T O R ：H a n d o n gW a n gM ．D ．P h ．D ．C h a p t e rII n t r o d u c t i o nI nt h i sc h a p t e r ，t h eb a c k g r o u n do ft h i ss t u d yi si n t r o d u c e d ，i n c l u d i n gt h er e v i e w so fs p i n a lc o r di n j u r y , s t r u c t u r ea n da c t i v a t i o no fK e a p l ··N r f 2 - —A R Ep a t h w a y ,n e u r o p r o t e c t i o no fN r f 2 ，i n t e r a c t i o n sb e t w e e nN r f 2a n dN F ·K Ba n dp h a r m a c o k i n e t i co fs u l f o r a p h a n e ．V IC h a p t e rI IA c t i v a t i o no ft h eN r f 2 一A R EP a t h w a yi sN e u r o p r o t e c t i V eF o l l o w i n gS p i n a lC o r dI n j u r yT h ea c t i v a t i o no fo x i d a t i v ed a m a g e ，n e u r o i n f l a m m a t i o na n dm i t o c h o n d r i a ld y s f u n c t i o nh a sb e e ni m p l i c a t e di ns e c o n d a r yp a t h o m e c h a n i s m sf o l l o w i n gs p i n a lc o r di n j u r y ( s c i ) ．T h e s ep a t h o 。