荧光分光光度法测定维生素b2的含量.doc

1荧光分光光度法测定维生素荧光分光光度法测定维生素 B B2 2的含量的含量 实实 验验 报报 告告————应用化学（环境检测与分析）应用化学（环境检测与分析）一、实验目的一、实验目的1 1、掌握标准曲线法定量分析维生素、掌握标准曲线法定量分析维生素 B B2 2的基本原理的基本原理2 2、了解荧光分光光度计的基本原理、结构及性能，掌握其基本操作了解荧光分光光度计的基本原理、结构及性能，掌握其基本操作二、实验原理二、实验原理1 1 什么是荧光？什么是荧光？荧光是光致发光当物质的分子接受光子能量被激发后，从激发单重态的最低振动能级返回荧光是光致发光当物质的分子接受光子能量被激发后，从激发单重态的最低振动能级返回基态时发射的光基态时发射的光2 23 3 荧光与环境因素的关系荧光与环境因素的关系取代基的性质、溶剂的极性、体系的取代基的性质、溶剂的极性、体系的 pHpH 和温度 维生素维生素 B2(VitaminB2(Vitamin B2)B2)，别名：核黄素，别名：核黄素(Riboflavin(Riboflavin，，RF)RF)，是橘黄色无臭的针状结晶，是橘黄色无臭的针状结晶, ,分子式：分子式：C C1717H H2020N N4 4O O6 6 ，相对分子量为：，相对分子量为：376.37376.37。

因其色黄且含有核糖醇，故称为核黄素结构式为：因其色黄且含有核糖醇，故称为核黄素结构式为：2由于分子中有三个芳香环，具有平面刚性结构，因此它能够发射荧光维生素由于分子中有三个芳香环，具有平面刚性结构，因此它能够发射荧光维生素 B B2 2易溶于水而易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定 维生素维生素 B B2 2溶液在溶液在 430430——440nm440nm 蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在 535nm535nm 附近维生素附近维生素 B B2 2在在 pHpH＝＝6 6——7 7 的溶液中荧光强度最大，而且其荧光强度与维生素的溶液中荧光强度最大，而且其荧光强度与维生素 B B2 2溶液浓度呈线性关系，因此可以溶液浓度呈线性关系，因此可以用荧光光谱法测维生素用荧光光谱法测维生素 B B2 2的含量维生素的含量维生素 B2B2 在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为另一物在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为另一物质质————光黄素，光黄素也是一个能发荧光的物质，其荧光比维生素光黄素，光黄素也是一个能发荧光的物质，其荧光比维生素 B B2 2的荧光强得多，故测维生素的荧光强得多，故测维生素B B2 2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。

的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行在稀溶液中，荧光强度在稀溶液中，荧光强度 F F 与物质的浓度与物质的浓度 c c 有以下关系：有以下关系：F F＝＝2.303ФI2.303ФI0 0εbcεbc当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度呈线性关系：当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度呈线性关系：F=KcF=Kc这是荧光光语法定量分析的依据这是荧光光语法定量分析的依据三、仪器与试剂三、仪器与试剂1 1、主要仪器：荧光分光光度计（日立、主要仪器：荧光分光光度计（日立 F F——70007000）） ；比色皿：；比色皿：1cm1cm；容量瓶：；容量瓶：50mL50mL；移液管：；移液管：5mL5mL2 2、试剂：核黄素；维生素、试剂：核黄素；维生素 B B2 2药片药片四、实验步骤四、实验步骤1.1. 溶液的配制溶液的配制标准溶液的配制：精确称取标准溶液的配制：精确称取 2 2 mgmg 核黄素核黄素(VB2)(VB2)，用超纯水于，用超纯水于 50ml50ml 棕色容量瓶中定容棕色容量瓶中定容待测液的配制：将维生素待测液的配制：将维生素 B B2 2药片研磨成粉末状，精确称取药片研磨成粉末状，精确称取 2mg2mg，用超纯水于，用超纯水于 50ml50ml 棕色容量瓶中定棕色容量瓶中定容；容；2.2. 扫描激发光谱和荧光光谱扫描激发光谱和荧光光谱3.3. 标准曲线的绘制标准曲线的绘制在室温条件下，分别吸取在室温条件下，分别吸取 1.01.0、、2.02.0、、3.03.0、、4.04.0、、5.05.0 标准溶液于标准溶液于 50ml50ml 棕色容量瓶中定容。

用超纯棕色容量瓶中定容用超纯水作空白试样，测定溶液荧光强度值用所测结果绘制荧光强度水作空白试样，测定溶液荧光强度值用所测结果绘制荧光强度(F)(F)对浓度对浓度(c)(c)的曲线34.4. 待测液待测液 VB2VB2 含量的测定及数据处理含量的测定及数据处理五、实验结果及数据处理五、实验结果及数据处理λλexex＝＝442nm442nm4λλemem＝＝524nm524nmVB2VB2 标准曲线及药片中标准曲线及药片中 VB2VB2 含量的测定（大浓度）含量的测定（大浓度）5VB2VB2 标准曲线及药片中标准曲线及药片中 VB2VB2 含量的测定（稀释到中间浓度）含量的测定（稀释到中间浓度）六、总结、讨论六、总结、讨论1 1、实验注意事项：、实验注意事项：（（1 1）配制标准溶液时，为了减少仪器偏差，取不同体积的同种溶液应用同一移液管配制标准溶液时，为了减少仪器偏差，取不同体积的同种溶液应用同一移液管2 2）因荧光是从石英池下部通过，所以拿取石英池时，应用手指捏住池体的上部，不能接触）因荧光是从石英池下部通过，所以拿取石英池时，应用手指捏住池体的上部，不能接触下部清洗样品池后，应先用吸水纸吸干四个面的液滴，再用擦镜纸往同一方向进行轻轻擦拭。

下部清洗样品池后，应先用吸水纸吸干四个面的液滴，再用擦镜纸往同一方向进行轻轻擦拭3 3）在使用荧光分光光度计时，须按照既定程序进行在测定系列标准溶液的浓度和荧光强）在使用荧光分光光度计时，须按照既定程序进行在测定系列标准溶液的浓度和荧光强度时，必须按顺序放入测定度时，必须按顺序放入测定4 4）在测试样品时，应注意样品的浓度不能太高，否则由于存在荧光猝灭效应，样品浓度与）在测试样品时，应注意样品的浓度不能太高，否则由于存在荧光猝灭效应，样品浓度与荧光强度不呈线性关系，造成定量工作出现误差荧光强度不呈线性关系，造成定量工作出现误差2 2、此次实验，影响标准曲线的线性的主要因素是配制溶液时，操作是否规范、标准此次实验，影响标准曲线的线性的主要因素是配制溶液时，操作是否规范、标准七、思考题七、思考题1 1、试解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因？、试解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因？答：由于现代电子技术具有检测十分微弱光信号的能力，并且荧光强度与激发光强度成正比，答：由于现代电子技术具有检测十分微弱光信号的能力，并且荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度也可以增大荧光强度，使测定的灵敏度提高；而吸收光度法测定的是吸光度，不管提高激发光强度也可以增大荧光强度，使测定的灵敏度提高；而吸收光度法测定的是吸光度，不管是增大入射光强度，还是提高检测器的灵敏度，都会使透射光信号与入射光信号以同样的比例增大，是增大入射光强度，还是提高检测器的灵敏度，都会使透射光信号与入射光信号以同样的比例增大，6吸光度值不会改变，因此灵敏度不能提高。

吸光度值不会改变，因此灵敏度不能提高2 2、维生素、维生素 B B2 2在在 pH=6~7pH=6~7 时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？答：因为维生素答：因为维生素 B B2 2在碱性溶液中经光线照射，会发生分解而转化为光黄素，后者的荧光比维在碱性溶液中经光线照射，会发生分解而转化为光黄素，后者的荧光比维生素生素 B B2 2的荧光强的多因此，测量时溶液要控制在酸性范围内进行的荧光强的多因此，测量时溶液要控制在酸性范围内进行。