他莫昔芬对人肝癌细胞增殖及ER表达影响探究.doc

他莫昔芬对人肝癌细胞增殖及ER表达影响探究作者：白文坤王文奇时昌文吴洪文【摘要】目的：研究他莫昔芬(Tamoxifen, TAM)对人 肝癌HepG2细胞增殖和HepG2细胞ER表达的影响方法： 按照TAM的浓度不同分为7.5 umol/L. 15 umol/L、30 umol/L 3组，对照组不加TAM,每孔加入1X105 mL-1细 胞0. ImL,培养24、48和72 h,采用MTT法测定抑制率； 细胞免疫组化染色观察TAM对肝癌细胞ER的表达的影响 结果：TAM抑制人肝癌细胞增殖及ER表达，并具有时间-浓 度依赖结论：TAM可能通过影响肝癌细胞ER的表达抑制肝 癌细胞增殖关键词】肝肿瘤•细胞增殖•他莫昔芬•受体，雌激 素[ABSTRACT 】 Objective：To study the effects of tamoxifen on proliferation and ER expression of human hepatocellular carcinoma cells・ Methods： HepG2 cells were treated with tamoxifen at different concentration and different action time. MTT was used to determine the suppression rate of 他莫昔芬(Tamoxifen,TAM) 是一种非笛体类抗雌激素药物，应用于肝癌治疗具有一定疗 效[1],但作用机制尚未阐明。

本研究通过检测人肝癌HepG2 细胞在TAM作用前后增殖活性变化及雌激素受体（estrogen receptor, ER）阳性表达的变化，探讨TAM在肝癌治疗中的 作用机制1材料与方法1. 1实验材料人肝癌细胞HepG2 （山东省普外学科重 点实验室提供）；即用型鼠抗人ER单克隆抗体（美国Sigma 公司）1.2细胞培养 将人肝癌HepG2细胞株常规培养于RPMI 1640培养液中（内加10%小牛血清），培养液中加入青霉素 （浓度 100 U/mL）和链霉素（浓度 100 H g/mL） ,37 C.5% C02培养箱中培养1. 3分组 按照TAM的浓度不同分为7.5、15、30 umol/L 及0 umol/L （对照组）4组，每组设6个平行孔1.4 MTT实验 取对数生长期HepG2细胞，用RPMI 1640 培养液调整细胞数为1 X105mL-l,加入96孔培养板，每孔 0. 1 mL, 37C、5% C02培养箱中过夜，待细胞贴壁约70%~80% 时，弃去细胞培养液，分别加入不同浓度的TAM 0. 1 mL,培 养20、44和68 h,每孔加入MTT 10 uL,继续培养4 h, 将培养液弃去，加入DMS0 150 uL/孔，振荡10〜15 min, 在492 nm处测定0D值，计算抑制率：抑制率（%） = （1-实验孔0D/对照孔OD） X100%1.5 ER免疫组织化学染色 将对数生长期的细胞传代后 置于6孔板中培养，培养液中分别加入不同浓度的TAM,培 养20、44、68 h,放入载玻片，再培养4h,置载玻片于4" 甲醇和丙酮混合液（1:1）中20 min,使细胞固定，PBS液 清洗3X3 min,清洗3次，甩去PBS液，每张载玻片加入 50 uL的非免疫性动物血清封闭,置37工温箱中孵育30 mino 采用SP法进行免疫组织化学染色。

分别在每张载玻片加入 50 uL即用型鼠抗人雌激素受体单克隆抗体即第一抗体,41 过夜；加入50 uL生物素标记的第二抗体，37C孵育1 h 后加入50 uL链亲和素-过氧化物酶溶液即第三抗体，37C 孵育40 min；加入100 u L新鲜配制的DAB显色剂显色，苏 木精复染，1%盐酸乙醇分色，梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透 明，中性树胶封片1.6结果判定ER阳性结果为细胞核棕黄色着色高倍 镜（X400）下计数500个细胞中染色阳性细胞数，计算ER 平均阳性表达率1.7统计学处理 采用SPSS13. 0统计学软件进行方差 分析，以PW0.05为差异有统计学意义2结果2.1 TAM作用后对肝癌细胞的影响TAM对人肝癌细胞 抑制率的影响呈明显时间-浓度依赖（F时间=140. 234,P=0. 000； F浓度=44. 031, P=0. 002）,时间的影响更明显 随着TAM作用时间延长，TAM对HepG2细胞的抑制作用逐渐 加强，24、48和72 h组之间相比差异均有统计学意义（均 P<0. 05）；不同浓度TAM组人肝癌细胞抑制率较对照组均明 显增高（均P<0. 05）, 30 umol/L组72 h抑制率最高，见 表lo2. 2 TAM对人肝癌细胞ER阳性表达的影响 TAM对ER 阳性率的影响呈明显时间一浓度依赖（F时间=70. 040, P=0. 001； F浓度=27. 992, P=0. 004）,时间的影响更明显。

24、48和72h组ER阳性率下降，且差异有统计学意义（均 P<0. 05）；不同浓度TAM对HepG2细胞ER的阳性率均有抑 制作用，人肝癌细胞ER的阳性率均较对照组明显降低（均P <0. 05）,其中30 nmol/L组72 h ER阳性率最低，见表23讨论雌激素长期刺激可导致肝肿瘤发病率升高［2］肝 细胞表达高亲和力的ER,肝癌细胞ER的表达较正常肝细胞 增加，雌激素通过ER介导的信号通路来诱导基因转录，从 而诱导肝癌的发生［3］另外，雌激素还可激活蛋白激酶C 来促进肝癌细胞的增殖［4］TAM是一种非脩体抗雌激素药物，其结构与雌激素 相似，在靶器官内竞争ER,减少细胞质内ER的含量，阻止核内 雌激素生成基因的转录和ER再合成在组织培养中可见ER 阳性细胞的生长可直接被TAM所抑制TAM还通过作用于信 号转导过程的MAPK通路、阻断蛋白激酶C介导的ERK激活、 激活TGF-B来抑制肿瘤细胞的生长［5-6］应用TAM治疗肝癌取得了一定疗效，体外实验发现 TAM可以抑制肝癌细胞的增殖，具有时间一浓度依赖性 ［7-8］o但TAM对肝癌细胞ER表达影响的文献报道很少 本研究通过MTT法发现，T AM能明显抑制人肝癌细胞的生长, 并且呈时间一浓度依赖。

随着TAM作用时间延长，其对HepG2 细胞的抑制作用不断加强，72 h组抑制作用最强；随着TAM 浓度增加，其对人肝癌细胞抑制率亦明显增加TAM对ER阳 性率的影响呈明显时间一浓度依赖，随作用时间延长，ER 阳性率下降；TAM浓度增加，HepG2细胞ER阳性率亦明显降 低，以30 umol/L组72 h ER阳性率最低提示TAM能抑 制肝癌细胞生长，TAM通过与雌激素竞争性结合受体抑制雌 激素的信号传导来抑制肿瘤细胞增殖，TAM还可能通过阻断 蛋白激酶C,进而减少细胞端粒酶活性、上调p27表达、影 响Ca2+通路等促进肝癌细胞的凋亡，抑制肝癌细胞的增殖， 但详细的机制有待于进一步研究［9-11］TAM可以抑制肝癌细胞的增值，且影响肝癌细胞ER 的表达，呈时间一浓度依赖，说明TAM可以通过影响肝癌细 胞ER的表达抑制肝癌细胞，为应用TAM治疗肝癌提供理论基础参考文献】[1] Lu YS, Hsu C, Li CC, et al. Phase II study of combination doxorubicin, interferon-alpha, and high-dose tamoxifen treatment for advaneed hepatocellular carcinoma[J]・ Hepatogastroenterology, 2004,51 (57) ：815-819.[2] Castro-Rivera E, Safe S. 17 beta~estradiol and 4-hydroxytamoxifen-induced transactivation in breast, endometrial and liver cancer cells is dependent on ER- subtype, cell and promoter context [J]・ Steroid Biochem Mol Biol, 2003,84 (1) : 23-31.[3] Waalkes MP, Liu J, Chen H, et al. Estrogen signaling in livers of male mice with hepatocellular carcinoma induced by exposure to arsenic in utero[J]・J Natl Cancer Inst, 2004,96 (6) :466-474.[4] Marino M, Distefano E, Caporali S, et al.beta~estradiol stimulation of DNAsynthesisrequiresdifferent PKC isoforms in HepG2 and MCF7 cells[J]・ J Cell Physiol, 2001,188 (2) ：170-177.[5] Zhang CC, Shapiro DJ. Activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway by estrogen or by 4-hydroxytamox i fen is coupled to estrogen receptor- induced apoptosis[J]・ J Biol Chem,2000,275(1) :479-486・[6] Liang Y, Hou M, Kallab AM. Indue tion of antiproliferation and apoptosis in estrogen receptor negative MDA-231 human breast cancer cells by mifepristone and 4-hydroxytamoxifen combination therapy： a role for TGFbetal[J]. Int J Oncol, 2003,23(2) :369-380.[7] Riss TL, Moravec RA. Use of multi pie assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin,and plating density in cell-based cytotoxicity assays [J]・ Assay Drug Dev Technol, 2004,2(1) ： 51-62.[8] Brandt S, Heller H, Schuster KD, et al. Tamoxifen induces suppression of cell viability and apoptosis in the human hepatobl astoma cell line HepG2 via down-regulation of telomerase activity[J]・ Liver Int, 2004,24 (1) :46-54.[9] Brandt S, Heller H, Schuster KD, et al. The tamoxifen-induced suppression of telomerase activity in the human hepatoblastoma。