表达分析北方旱地红小豆DREB2A基因克隆情况.docx

表达分析北方旱地红小豆DREB2A基因克隆情况低温、高温、干旱、土壤盐渍化是主要非生物逆境，在非生物逆境条件下，会导致植物生理代谢紊乱、细胞结构损伤，植株生长发育受阻，严重时可导致死亡但生物适应性潜能也是被科学所证明了的，为应对非逆境环境对植物生长发育的不利影响，在长期的生物进化中，形成了明显的抵抗非生物逆境胁迫的应激反应机制和生态适应性(付晨熙等,2016)其中，特异基因的存在和进化发挥了极其重要的应对逆境胁迫的响应和调控作用研究和探索这些具有特定功能和作用的基因，对从基因层面揭示植物抵抗逆境胁迫的机理机制，进而利用分子育种手段和遗传工程技术提高植物的抗逆性，无疑是一条有效途径(魏晓玲,2014)DREB转录因子是AP2/EREBP家族的一个亚族，是与启动子区域DNA相互作用的蛋白质，它能够抑制或激活其他基因转录表达DREB转录因子同时能与DRE/CRT顺式作用元件或具有DRE元件的核心序列(CCGAC)特异结合，参与调控逆境相关基因的表达(柏星轩等,2017)，并被非生物胁迫所诱导，对提高植物对胁迫的抗性能力功不可没研究发现，在拟南芥植株中，与逆境相关的DREB转录因子主要有DREB1/CBF和DREB2两大类，其中DREB/CBF转录因子能特异结合DRE/CRT顺式作用元件，在植物受到低温等逆境胁迫时，它们能够特异性的与逆境响应基因启动子DRE/CRT顺式元件相结合(董亚茹等,2017,山东农业科学,49(10):139-142)，从而调节其它应激反应基因，激活逆境诱导基因表达，增强植物的抗逆性。

由于一个转录因子可以调控多个相关基因表达，因此，在通过基因手段提高植物抗逆性方面，仅靠转移单个基因比较困难，通过增强转录因子的调控能力来提高植物的抗逆性就显得更为有效(RiechmannandMeyerowitz,1998;KitajimaandSato,1999;Fujimotoetal.,2000;Guoetal.,2004)同时，由于DREB转录因子还能够被非生物胁迫所诱导，所以在转基因表达时对提高植物胁迫的抗逆性效果明显(Jaglo-Ottosenetal.,1998;Tangetal.,2005)综上所述，DREB2A在其中心区域有一个负调控结构域，它的缺失能够使DREB2A转化为本构式的活性形式，同时能激活许多胁迫诱导基因的表达，从而提高转基因植物的耐旱性通过研究发现，DREB2A和DREB1A均能与DRE序列结合，但对不同DNA碱基对组成的亲和力略有不同在DRE核心基序中，每个基因的下游基因都有部分差异，SGFP与DREB2ACa融合的绿色荧光信号显著高于在非胁迫控制条件下融合到转基因植株细胞核中的DRE核心基序的绿色荧光信号，说明DRE蛋白的稳定性对其激活具有重要意义，而在非胁迫条件下DRE核心基序的绿色荧光信号显著提高，并能够增强植物对干旱胁迫的忍耐性(Sakumaetal.,2006)。

由于DREB转录因子可以调控与干旱、高盐及低温耐性有关功能基因的表达，因此利用DREB转录因子来改良植物抗逆性能够获得较理想的效果(李杰等,2003)目前，在拟南芥、水稻等模式植物中获得了大量DREB2A的研究数据，而在红小豆、绿豆、豌豆等豆科作物的研究较少红小豆是重要的食、药两用性作物，逐渐受到人们的重视但红小豆在作物布局及生产栽培中一直处于填闲及救灾补种作物，再加上本身产量不高，一直以来并未受到农民的重视为了推广红小豆新品种在适宜地的大面积种植，本研究从遗传学的角度阐明非生物学逆境是由DREB2A基因控制的，研究结果可为育种工作者培育红小豆抗逆新品种提供生物学基础1、结果与分析1.1红小豆DREB2A与其它物种间氨基酸序列比对分析蛋白质在功能表现中总是体现某些区段氨基酸序列的保守性因此，在NCBI数据库中，将红小豆DREB2A氨基酸序列与数据库信息进行基因序列比对，找出序列之间相同的区域结果显示：与麻疯树(Jatrophacurcas)XP＿012086678.1的序列比对一致性为83%；与菡萏(Nelumbonucifera)XP＿010257031.1和蓖麻(Ricinuscommunis)XP＿002520794.1序列比对一致性分别为80%和82%。

从比对结果中可以看出：位于红小豆DREB2A序列63～160bp间的某些氨基酸残基较其他位置的氨基酸残基保守性更高，表明这些保守位点上的氨基酸残基对蛋白质的结构和功能是至关重要的，对红小豆DREB2A基因的功能起决定性作用(图1)1.2红小豆DREB2A的生物信息学分析1.2.1DREB2A的蛋白质分子组成及物化性质检测DREB2A蛋白的分子组成及理化性质，结果表明：其分子式为C1840H2834N524O618S15，预测分子量为42664.78，理论等电点pI为4.82，其中丝氨酸Ser(38,9.9%)，天冬氨酸Asp(38,9.9%)，亮氨酸Leu(29,7.6%)，甘氨酸Gly(28,7.3%)，丙氨酸Ala(28,7.3%)，谷氨酸Glu(27,7.0%)，赖氨酸Lys(24,6.2%)，天冬酰胺Asn(21,5.5%)，精氨酸Arg(20,5.2%)，谷氨酰胺Gln(14,3.6%)，脯氨酸Pro(20,5.2%)，缬氨酸Val(18,4.7%)，苏氨酸Thr(17,4.4%)含量较高，半胱氨酸Cys(7,1.8%)，异亮氨酸Ile(7,1.8%)，色氨酸Trp(5,1.3%)含量较低。

不稳定指数为41.59，平均亲水指数为-0.850，物理上属于不稳定蛋白质，同时属于亲水性蛋白(图2)图1红小豆DREB2A与其他物种DREB2A的氨基酸序列比对图2DREB2A蛋白的亲水性预测1.2.2DREB2A的高级结构预测分析DREB2A蛋白的二级结构是用软件SOPMA进行预测的，结果显示：在DREB2A蛋白结构中存在大量的无规则卷曲和α-螺旋，分别占氨基酸总量的60.68%和28.12%延伸链和β转角仅占氨基酸总量的7.55%和3.65%其中无规则卷曲元件占60.68%，成为蛋白质分子功能实施和构象的重要区域，具有明确而稳定的结构(图3)再利用SWISS-MO-DEL对其三级结构进行预测(图4)，发现仍然以无规则卷曲为空间主要区域1.2.3DREB2A蛋白信号肽、细胞定位和跨膜结构预测信号肽是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链，信号肽预测的功能是预测给定的氨基酸序列中是否存在潜在的信号肽剪切位点及其所在位置存在于分泌蛋白的N端序列可作为信号肽，而分泌蛋白是先在细胞内合成，行使蛋白功能时需要分泌到细胞外，信号肽能够引导分泌性蛋白移动到内质网膜上合成，信号肽一般在蛋白合成结束前就会被切除。

利用信号肽预测程序SignalP进行预测，DREB2A的meanS值为0.101，小于0.5，结果表明DREB2A不属于分泌蛋白(图5)游离的核糖体将其合成后，DREB2A进入胞质溶胶蛋白质中，参与细胞核、线粒体、过氧化物酶体等的生化反应图3DREB2A蛋白质的二级结构预测图4DREB2A蛋白质的三级结构预测利用TMHMM软件对蛋白的跨膜结构进行预测，结果表明，该蛋白质属于定位在细胞质基质或细胞器基质中的蛋白质，不属于膜蛋白或分泌蛋白1.2.4DREB2A在不同物种间的同源性分析利用氨基酸序列比对产生分子进化树(系统发育树)结果表示，来自不同植物的DREB2A主要有三大类，其中红小豆与沙冬青有较高的同源性，达到98%(图6)1.3DREB2A在种子不同吸水段中的相对表达量分析实验设计以储藏状态的干种子中DREB2A的表达量为对照，以Actin为内参，利用qRT-PCR法分析DREB2A基因在小豆吸水萌发不同时期中的表达量(Gimenoetal.,2014)结果表明(图7),DREB2A表达量在吸涨及萌发的不同时期均有表现，但数值的变化发生呈递减状态，即在干种子和吸水3h后的表达量高，以后随吸水时间的延长，该基因表达量变少。

2、讨论红小豆作为小宗粮豆，具有广泛的生态适应性，但由于地理位置、气候变化等原因影响红小豆的产量及品质因此，开展红小豆非生物胁迫耐受机制的研究，对于提高红小豆产量及品质具有重要意义本研究在红小豆中鉴定出1个与拟南芥直系同源的DREB2A基因，该蛋白不具有信号肽，二级结构主要以无规则卷曲为主，与红小豆DREB2A亲缘关系近的植物是沙冬青荧光定量PCR技术分析结果表明，在红小豆非生物胁迫的调控中红小豆DREB2A也起到重要作用图5DREB2A蛋白信号肽预测图6DREB2A的系统进化分析AP2/EREBR是植物特有的一类转录因子家族，而DREB2A就属于此家族DREB亚家族具有保守的AP2结构域，一般由57～70个氨基酸残基组成，DREB蛋白通过其功能域(核定位信号,转录调控区,DNA结合区,寡聚化位点)与靶基因或启动子中等顺式作用元件相互作用，对靶基因的表达进行调控，在非生物胁迫信号传递中起重要作用，能够调控植物的生长发育目前，关于DREB2A基因的克隆和鉴定已经在很多物种中进行过(LataandPrasad,2011)，包括拟南芥、水稻、玉米、大豆、小麦、油菜等，且技术成熟，但在红小豆中的研究较少，尚无对红小豆中DREB2A家族基因进行鉴定和分析的报道。

通过对红小豆种子DREB2A基因的生物信息学分析及其表达特征的探究，发现在其N端的结构域63～160bp存在一段相对保守的序列Sakuma等(2006)在对拟南芥干旱响应过程中DREB2A功能分析时发现，DREB2A的136～165残基区域对于细胞核内该蛋白的稳定性有重要作用，这种稳定性对于蛋白活性至关重要(Sakumaetal.,2006)利用qPCR检测DREB2A在红小豆干种子萌发后0、3h、6h的相对表达量发现，其在安全储藏状态表达量较高，一旦吸水吸胀，含量呈递减状态这可能与干种子在吸胀之后，种子内的ABA含量下降有关Lim等(2007)发现DREB2A的表达会受到ABA的促进，因此种子萌发后，由于ABA含量下降而导致DREB2A的表达量下降但是，近年来也有相关研究表明，DREB2A的表达在不同植物中通过非依赖ABA信号转导途径上调(Mizoietal.,2012)因此，红小豆中DREB2A的表达是否受到ABA诱导，还要进一步进行实验验证图7DREB2A在红小豆不同吸水时间中的表达量分析本研究初步探究了红小豆DREB2A的基因与非生物胁迫之间的联系，为后续研究红小豆逆境生理提供了帮助，若要确定红小豆DREB2A基因如何参与逆境相关代谢途径，还需要通过正向、反向遗传学实验进一步验证。

研究结果为开展红小豆胁迫生理研究，并根据不同地域的自然环境进行标准化种植，提高红小豆的产量和品质，进而培育高抗优质适应性广的红小豆新品种有所帮助3、材料与方法3.1材料及处理本研究采用的红小豆(Vignaumbellata(Thunb.)OhwietOhashi)品种为‘白玉4号’，是小杂粮国家区试在西北地区连续6年综合表现优良的红小豆品种种子的种植、收获及储存都是在甘肃庆阳陇东学院实验农场进行选取大小一致，籽粒饱满，无病虫害的红小豆种子作为实验材料在种子萌发期间的不同时间段进行取样，液氮速冻后研磨并提取mRNA3.2红小豆DREB2A基因鉴定与信息分析利用拟南芥数据库TAIR网站下载拟南芥的DREB2A基因序列在Phytozome网站与红小豆基因序列数据库进行比对(Goodsteinetal.,2012)，得到1个DREB2A蛋白基因序列用IBCP工具SOPMA预测DREB2A的蛋白质二级结构；通过SWISS-MODEL预测三级结构；利用DNAMAN软件分析其疏水性；使用MEGA7软件，以邻近法生成系统进化树(张雪薇等,2。