PTPN1基因单核苷酸多态性与2型糖尿病的相关性.doc

PTPN1基因单核昔酸多态性与2型糖尿病的相关性作者：丁岩军彭惠尺作者单位：重庆医科大学细胞生物学及遗传学教研室，重庆400016【摘要】 目的研究蛋白酪氨酸磷酸酶N1基因(PTPN1)单核廿酸多态性(SNP)与中 国西南地区汉族人2型糖尿病(T2DM)的相关性方法 采用患者对照研究，选取OGTT 试验确诊的T2DM患者108例，相同地区年龄和性别频数匹配的对照102例，以双向等位 特异性聚合酶链反应法(Bi PASA)检测PTPN1基因三个SNPs rs2904268 C/G、 rs2230605 A/G和rs16995309 C/T的基因型统计分析基因多态性结果PTPN1基因三 个SNPsrs290426& rs2230605和rs 16995309基因型频率及等位基因频率在T2DM病例 组及对照组中的分布无显箸差界三个SNPs构成的八种单体型中，中国西南地区汉族人 群中最常见的为CAC、GAC、GGC (PV0.05)CAC和GAC在T2DM病例组及对•照组 中的频率分布无显苦差界单体型GAT、GGC、GGT在T2DM病例组及对照组中的频率 分布具有显著的统计学差异(P值分别为0.005 001 > 0.001 465、0.011 742) o结论PTPN1 基因三个 SNPsrs2904268、rs2230605、rs16995309 构成的单体型 GAT、GGC 和 GGT 可能与中国西南地区汉族人T2DM相关。

关键词】2型糖尿病；蛋白酪氨酸磷酸酶N1基因；胰岛素抵抗基金项目：重庆医科人学创新基金(CX200302)目前，已有充分的依据支持2型糖尿病(T2DM)是遗传性的疾病门，2),与糖 尿病相关的中间性状如胰岛素敏感性和胰岛素分泌的家族聚集的现象，也支持遗传因素参与 了对T2DM易感性的决定以单核廿酸多态性(SNP)作为遗传学标记的关联研究方法发 现T2DM的易感基因是一项简便易行的策略蛋白酪氨酸磷酸酶N1基因(PTPN1)编码 蛋口质酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B), PTP1B是去磷酸化胰岛素信号传导途径中信号分子磷 酸化的酪氨酸残基，从而阻止胰岛素信号传导级联放人效应，因此PTPN1基因的多态性与 T2DM可能存在着相关性木研究探讨PTPN1基因三个SNPs rs2904268、rs2230605> rs16995309不同基因型、等位基因及其单休型与T2DM的相关性1对象与方法1.1对象T2DM患者108例，男60例，女48例，年龄(59.0±3.28)岁，均为中国 西南地区汉族人，T2DM的诊断依据WHO(1985)诊断标准，即空腹血糖>7.8 mmol/L或 0GTT2h 血 ^>11.1 mmol/L,T2D M 病例组空腹血糖(10.41±6.99) mmol/L > 餐后 2h 血 糖(20.91±12.48) mmol/Lo 对照组 102 例,男 57 例,女 45 例,年龄(54.8±5.01)岁)， 为相同地区年龄和性别频数匹配，无高血糖、T2DM家族史、高血压及代谢相关疾病。

收集 每个研究对象的外周血3〜5mL提取白细胞染色体基因组DNA,于・20°C保存1.2方法PTPN1基因SNPs基因型分析采用双向等位特界性聚合酶链反应(Bi PASA PCR) (3)方法分析PTPN1 基因 rs2904268 C/G、rs2230605 A/G 和 rs16995309 C/T的基因型Taq酶套装由重庆升博科技冇限公司提供，使用USA BIO RAD GeneCyclerTMPCR仪利用Primer Premier 5.0软件设计各SNP位点引物，用NCBI的Blast 2.0软件检验其特界性引物山北京三博远志纶物技术有限责任公司合成（表1）PCR反应体系25 pl（大约50 ng基因组DNA,浓度12.5 pmol/L的引物AB各1.0 pl、 PQ 各 0.8 pl, 25 mmol/L MgCI2 0.1 pl,2.5 mmol/L dNTP Mixture 2.0 pl, 10xPCR 缓冲液 （20 mmol/L Tris HCI,100 mmol/L KCI,0.1 mmol/L DDT,50% Glycerol,0.5%Tween20, 0.5%NP 40,15 mmol/L MgCI2） 2.5 pl。

rs290426& rs2230605> rs16995309 PCR 退火 温度分别为51°C、52°C、58°Co取PCR产物10 pl,浓度1.5%的琼脂糖凝胶90 V电泳40 min检测电泳结果取Bi PASA PCR产物进行测序1.3统计学分析 对各SNPs的基因型分布进行Hardy Weinberg遗传平衡检验，估 测样木的群体代表性，假设检验公式为：x2=（a+b+c）（b2 4ac）2/（2a+b）2（b+2c）2,式中:H 由度二基因型数■等位基因数a、c为纯合基因型实际观测值,b为杂合基因型实际观测值 以Pearson x2检验比较PTPN1基因SNPs各基因型、等位基因及单体型在T2DM病例组 与对照组之间分布的差异统计分析采用SPSS12.0统计软件进行处理等位基因、单体 型比较采用比值比（odd ratio,OR）oPTPN1基因三个SNPs位点构成的单体型频率用SHEsis 软件进行计算2结果图 1 PTPN1基因 SNP rs2904268 C/GBi PASA PCR 产物电泳图（略）2.1 PTPN1 SNPs Bi PASA PCR 产物 见图 1 〜图 3。

2.2 PTPN1基因三个SNPs Bi PASA部分PCR产物测序结果 见图4〜图6表1 PTPN1基因三个SNPs位点引物及PCR扩增片断长度（略）图 2 PTPN1 基因 SNP rs2230605 A/G Bi PASA PCR 产物电泳图（略）图 3 PTPN1 基因 SNPrsI6995309 C/T Bi PASA PCR 产物电泳图（略）图4图（略）PTPN1 基因 SNP rs2904268 BiPASA PCR 产物AQ片断测序部分结果图5PTPN1 基因 SNP rs2230605 BiPASA PCR 产物AQ片断测序部分结果图（略）图6PTPN1 SIS SNP rs16995309 BiPASA PCR 产物PB片断测序部分结果图（略）2.3 PTPN1基因三个SNPs基因型频率分布见表2PTPN1基因三个SNPs位点 rs290426& rs2230605. rs16995309 经 Hardy Weinberg 遗传平衡检验，实际基因频率 与期望基因频率的差片无统计学意义（P>0.05）,其分布符合Hardy Weinberg平衡 三个SNPs位点基因型频率分布在T2DM病例组及正常对照组中的分布无差界。

表2 PTPN1基因三个SNPs基因型频率分布（略）2.4 PTPN1基因三个SNPs病例组和对照组单体型频率的分布PTPN1基因三种 SNPs构成的八种单体型小在中国酋南地区汉族人样中最常见的单体型为CAC、GAC、 GGCo GAT、GGC、GGT单体型频率在T2DM病例组及正常对照组的分布具有显著差界（P 值分别为 0.005 001 > 0.001 465、0.011 742） , OR 值分别为 0.404、0.426、3.304； 95%CI分别为0.212〜0.773、0.250〜0.72& 1.242〜8.784,提示三种单体型与中国西南地 区汉族人T2DM可能存在关联表3病例组和对照组单体型频率的分布（略）2.5 PTPN1基因三个SNPs等位基因频率分布 见表4PTPN1基因三个SNPs位点 等位基因频率分布在T2DM病例组及正常对照组中的分布无差异（P>0.05） o表4 PTPN1基因三个SNPs等位基因频率分布（略）3讨论T2DM发生发展可由遗传和环境因素的相互作用引起，其中，胰岛素信号转导障碍在发 病机制中所起的重要作用Xu等 ⑷ 用RNA干扰技术下调肝肿瘤细胞中PTP1B的表达, 结果上调了胰岛素信号的传导，PTPN1基因敲除小鼠不仅胰岛素敏感性增强，对饮食诱导 的肥胖有很强的抵抗作用，11在肌肉和肝组织中，胰岛素诱导的受体的酪氨酸磷酸化增加（5）,说明PTP1B是胰岛素信号转导关键的负调控因子。

编码PTP1B的PTPN1基因于1990年首次克隆成功，定位于20 ql3.1〜q13.2许多 研究发现PTPN1基因DNA序列的变异、SNP与T2DM相关Di Paola等（6）运用聚合 酶链反应单链构象多态法（PCR SSCP）,在意大利两个不同人群中发现3,非翻译区的 1484insG（1484G插入突变）变异与胰岛素抵抗相关对基因型不一致的同胞对进行家系相 关研究，携带1484insG的受试者骨骼肌中PTPIBmRNA呈现过度表达在人胚肾细胞中 分别转染1484insGPTP1B和野生型PTP1B,前者mRNA的稳定性显著高于示者因此， 携带1484insG基因型的个体可能对于治疗胰岛素抵抗的PTP1B抑制剂比较敏感PTPN1编码区的变异比较少见Mok等⑺在Oji Cree印第安部落样本人群研究 中确定了 981C-T多态性，没有T等位基因的纯合体，该多态性Oji Cree印第安部落 T2DM患者糖耐量受损有关，但与西班牙美国人群研究中葡萄糖稳态的六个参数无关（8） o Echwald等 ⑼ 在体外试验中发现Pro387Leu变界与T2DM和PTP1B丝氨酸磷酸化受 损有关，芬兰样木人群（10）研究报道该突变与T2DM无相关。

Weng等（11）运用PCR 和限制性片断长度多态性检测中国南方汉族人群Pro387Leu变界，证实了 Pro387Leu在中 国汉族人群中存在，但是该变异与T2DM不札I关木研究是 PTPN1 基因三个 SNPs 位点 rs2904268 .rs2230605.rs16995309 与 T2DM 相关性的研究TPN1基因三个SNPs基因型频率及等位基因频率分布在T2DM病例组及 对照组中的分布无显著差异GAT、GGC、GGT单体型频率在T2DM病例组及正常对照组 的频率冇显著统计学差异，提示三种单体型与中国西南地区汉族人T2DM可能存在关联其中 GAT、GGC OR 值分别为 0.404、0.426, 95%CI 分别为 0.212〜0.773、0.250〜0.728, 提示携带该单体型的人群罹患T2DM的风险较低；GGTOR值为3.304, 95%CI为1.242- 8.784,提示携带该单体型的人群罹患T2DM的风险较正常人群高本研究首次采用Bi PASA PCR法检测PTPN1基因SNPs基因型，该方法具有较高 特界性，可重复性和费用低廉等优点部分PCR产物经DNA直接测序验证了该方法的准 确性。

研究了 PTPN1基因三个SNPs单体型与T2DM的相关性，单体型包含着多个SNP 的遗传信息，在T2DM这类复杂疾病的相关分析中，采用单体型比单个SNP具有更好的统 计分析效果和应用价值所获得的研究结果为今后PTPN1基因功能学研究及T2DM的个体 化预防、治疗提供一定的理论基础综上，PTPN1基因SNP多态性及变异可能与T2DM有联系但PTPN1基因的遗传分 析往往是局限于某一种族人群样木中进行的，且不同国家和群体的研究结果也不尽相同因 此，PTPN1基因与T2DM间的关系尚有待各国研究者进一步证实参考文献】1 NewmanB, Selby JV, King MC,et al.Concordance for Type II (non insulin depe。