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关于噬菌体实用保藏方法的研究进展 丛聪 袁玉玉 渠坤丽 耿慧君 王丽丽 李晓宇 徐永平 大连理工大学生命科学与技术学院 动物性食品安全保障技术教育部工程研究中心 大连赛姆生物工程技术公司 摘 要： 近年来, 噬菌体在人、畜疾病防控以及食品安全保障方面应用的研究愈发受到人们的重视, 并已逐渐显示出替代抗生素的巨大潜力然而, 不当保藏方法引发的噬菌体效价降低甚至失活现象屡有发生, 这不仅导致应用的失败, 而且严重动摇了人们将噬菌体视为抗生素替代品的信心鉴于此, 本文作者收集、归纳、整理了多年来, 特别是近年来有关噬菌体不同保藏方法 (如悬液法、冻液法和干燥法) 、不同影响因素 (如介质、分散剂和温度) 等方面的文献, 整合分析以期找出维持噬菌体高活性的规律和恰当的方法, 为未来噬菌体的广泛应用奠定理论基础关键词： 噬菌体; 保藏; 悬液; 干燥; 稳定剂; 作者简介：丛聪, 女, 生于 1989 年, 在读博士研究生, 主要研究方向为水产动物免疫;E-mail:congcong8902@作者简介：徐永平 E-mail:xyping@收稿日期：2017-03-23基金：国家海洋公益项目 (No.201405003-3) Research progress on the methods of bacteriophages collectionCong Cong Yuan Yu-yu Qu Kun-li Geng Hui-jun Wang Li-li Li Xiao-yu Xu Yong-ping School of Life Science and Biotechnology, Dalian University of Technology; Abstract： In recent years, bacteriophages have received intensive attentions for their extensive applications in the disease prevention for both human and animals instead of antibiotics, and in the prevention of food safety. Despite their advantages, the phage titer reduction and deactivation frequently occur due to improper preservation methods, thus lowering their values as antibiotics alternatives. To further interpret this issue, the academic literature on the preservation methods (e.g., suspension, freezing, and drying) and different factors (e.g., agents, dispersants, and temperature) for bacteriophages were collected, summarized, and reviewed over the forty years. After simultaneously integrating and analyzing the documents, the findings suggest that we need to find out the rules and the appropriate methods to maintain high activity of bacteriophages, which lay the theoretical foundation for the future applications of bacteriophages.Keyword： Bacteriophages; Storage; Suspension; Drying; Stabilizer; Received： 2017-03-23目前抗生素在控制人、畜细菌性传染病方面的作用不容置疑。

然而, 抗生素的滥用也带来了如药物残留、细菌耐药性和体内体外环境中菌群失调等诸多问题近 20 年来, 噬菌体 (bacteriophage, 常称为 phage) 作为抗菌剂已逐渐展现出替代抗生素的巨大潜力, 并表现出迅猛增长的研究态势噬菌体是细菌的天敌, 本质上是一种有益病毒, 具有体积小[1]、特异性高、稳定性强、安全性高及绿色环保等特点噬菌体用于养殖业可提高畜、禽、鱼等动物的存活率和生长率, 用于医疗可降低患者细菌性疾病的发病率及死亡率, 用于食品业可延长食品的保鲜期因此, 噬菌体具有广阔的应用前景[2]噬菌体属极微小的生物, 其活性受各种不同因素的影响, 从其制备到实际应用这段时间的保藏条件至关重要, 为最大限度地发挥其功效, 人们尝试了多种不同的保藏方法目前国内外关于噬菌体的实用保藏方法主要分为悬液法 (suspension) 、冻液法 (freezing) 和干燥法 (drying) 每种噬菌体的性质各不相同, 若保藏方法不当会造成极大损失要使噬菌体在长期保藏条件下还具有较高的活性及稳定性, 并且不被污染, 不仅需要考虑其各自特性[3], 还需考虑如介质、分散剂和温度等外界影响因素。

如何维持噬菌体的高活性, 找到简便且成本低廉的保藏方法是当务之急本文就噬菌体保藏的相关文献和问题进行收集、归纳总结和分析, 以期找到最有效的保藏方法, 为今后噬菌体大规模生产及应用奠定基础1 主要的实用保藏方法1.1 悬液法悬液法是指直接保藏噬菌体的原液或加入保护剂进行保藏, 维持噬菌体的液态形式, 目前有约 40%的文献提到使用此法本法优点是操作简便、成本低, 适于工厂生产缺点是易受污染, 不适于大批量运输悬液法按照不同的保护介质主要分为以下几种:1.1.1 噬菌体原液此法指直接保藏噬菌体原液或培养液例如志贺菌 (Shigella) 噬菌体 C16[4]、溶源性发酸乳杆菌 (Lactobacillus fermentum) 噬菌体 YB5[5]、金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 噬菌体 JS01[6-7]、3 种副溶血弧菌 (Vibrio parahaemolyticus) 噬菌体[8-9]、耻垢分枝杆菌 (Mycobacterium smegmatis) mc155 噬菌体 Y028T[10]、鲍曼不动杆菌 (Acinetobacter baumannii) 噬菌体IME-AB6[11]、3 种沙门菌 (Salmonella) 噬菌体[12-13]等均用本法保藏在 4℃。

大连理工大学 ABTNL 实验室的保藏方法也属此法, 先将筛选出的噬菌体进行纯化、过膜, 悬浮于培养液中于 4℃保藏 6 个月, 使用前再次过膜、活化另外, 也有报导将噬菌体原液保藏于其他温度中例如 Van 和 Yousten[14]发现将苏云金杆菌 (Bacillus thuringiensis) 噬菌体 CP-51 培养液保藏于室温后的活性远高于 4℃由此可见, 噬菌体原液在液态时可长期保藏, 效价基本维持稳定, 若工厂大规模生产时可选用此法保藏噬菌体1.1.2 以甘油作为保护剂本法是将甘油加入噬菌体富集液或浓缩液内, 存放在指定温度中谢慧君[2]以大肠埃希菌 (Escherichia coli) 3-2 为宿主菌筛选出 3 种噬菌体, 发现噬菌体富集液中加入甘油在 1 个月内于 4℃保藏效果最佳苏胜兵[10,15]将耻垢分枝杆菌 mc155 噬菌体 CJAUS9 与甘油混合, 可在 4℃保藏 6 个月1.1.3 以氯仿作为保护剂氯仿 (CHCl 3) 具有除菌抑菌的效果, 添加氯仿后一般保藏在 4℃例如李太武等[16]用胨水提取出河流弧菌 (Vibrio fluvialis) Ⅱ的噬菌体后加入氯仿保藏了 6 个月。

代保英[17]在 3 种噬菌体原液中滴加 1 滴氯仿进行保藏黎尔纳等[18]发现在木糖氧化无色杆菌 (Achromobacter xylosoxidans) 的 3 种噬菌体中分别加入氯仿, 可保藏 16 个月但也有研究报道认为氯仿不适合用于有尾或丝状噬菌体的保藏[19]因此, 氯仿的添加与否取决于噬菌体的种类及需求度, 若有特殊需要可适当添加以稳定活性1.1.4 以噬菌体保存液作为保护剂噬菌体保存液通常称为 SM 缓冲液 (supermicro buffer) 或 SM 液, 主要由硫酸镁、氯化钠、Tris 和明胶等组成一般用于噬菌体的稀释及保藏, 通常存放在4℃, 常见有两种方法: (1) 富集液加 SM 液; (2) 噬菌斑加 SM 液例如陈萍等[20]从出血性大肠埃希菌 (Enterohemorrhagic Escherichia coli) EDL933 中筛选出一株噬菌体 933W, 发现加入 SM 液、Ca Cl 2、Mg Cl 2和 0.1%的明胶后制成混合液保藏 1 个月, 效价仅降低 1log马永生等[21]用 SM 液重悬鼠伤寒沙门菌 (Salmonella enterica serovar Typhimurium) 50220 的噬菌体 Felix O1颗粒后给鸡灌服, 药效可持续 2~3h, 对家禽沙门菌病治疗效果显著。

另外, 哈维弧菌 (Vibrio harveyi) 的 2 种噬菌体[22]、沙门菌的 2 种噬菌体[12]和铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) 噬菌体 YH6[23]与 SM 液分别混合后均可有效保藏噬菌斑的保藏原理与富集液类似, 例如周明[24]将产肠毒性大肠埃希菌 (Enterotoxigenic Escherichia coli) O101 的噬菌体 P3 的噬菌斑切下, 可直接放入 SM 液中保藏由此可见, SM 液可有效维持噬菌体的活性及效价, 并可选用此法保藏噬菌斑1.1.5 其他此外, 有研究将噬菌体悬浮于无菌且低浓度的糖溶液中, 保藏于冷暗处, 但较高浓度的糖溶液不利于稳定[25]例如 Dini 等[26]向含有大肠埃希菌噬菌体CA933P 的 SM 液中加入低浓度蔗糖, 在 4 个月内能维持噬菌体的稳定另外, 有研究将噬菌体悬浮于不含养分的溶液中保藏, 如氯化钙[20]、氯化镁[20]等例如, 谢慧君[2]尝试用 Na OH 调节 p H6.0 的 X 液来保藏噬菌体, 发现在 32℃可保藏 2 个月, 这既解决了污染与存活率的问题, 也降低了成本, 为噬菌体保藏方法提供了新的参考依据。

彭丽等[27]发现将分枝杆菌 (Mycobacterium) 噬菌体 D29 与 5 种配比的液体稳定剂分别混合, 保藏 28 周后发现效价均未降低1log 以上许维素等[28]申请了一种液体保护剂, 与噬菌体原液混合后可于室温或 2~7℃长期保藏因此, 在保证噬菌体活性及效价的同时, 可尝试使用新的保护剂来保藏噬菌体1.2 冻液法本法是指在-20℃及以下的低温冷冻条件保藏噬菌体, 保藏温度及保藏时间各不相同, 研究中约有 30%的文献使用此法许多种类的噬菌体在普通冰箱的冷冻层 (约-20℃) 能保藏地很好, 理论上在足够低的温度下可无限期保藏但实际保藏中可能发生细微的温度变化, 以至溶液冻融, 影响活性, 若溶液中含 Na Cl 还可能发生变性及“盐伤”[29]因此可选用如干冰 (-70℃) 、超低温冰箱 (-80℃) 、液氮 (-196℃) 等方式进行保藏, 存活率为 10%~100%, 干冰和液氮的优势是无须担心停电事故。