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细菌分类与鉴定￿￿￿￿Still￿waters￿run￿deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深￿￿￿￿Where￿there￿is￿life,￿there￿is￿hope有生命必有希望有生命必有希望 地球上的物种估计大约有地球上的物种估计大约有150万，万，其中微生物超过其中微生物超过10万种，而且其数目还万种，而且其数目还在不断增加在不断增加生物分类的二种基本原则：生物分类的二种基本原则：a）根据表型）根据表型(phenetic)特征的相似程度分群归类，这种特征的相似程度分群归类，这种 表型分类重在应用，不涉及生物进化或不以反映生表型分类重在应用，不涉及生物进化或不以反映生 物亲缘关系为目标物亲缘关系为目标b）按照生物系统发育相关性水平来分群归类，其目标）按照生物系统发育相关性水平来分群归类，其目标 是探寻各种生物之间的进化关系，建立反映生物系是探寻各种生物之间的进化关系，建立反映生物系 统发育的分类系统统发育的分类系统从进化论诞生以来，已经成生物学家普遍接受的分类原则从进化论诞生以来，已经成生物学家普遍接受的分类原则生物系统学生物系统学(systematics)(systematics)一、分类单元及其等级一、分类单元及其等级界界 （（Kingdom）） (Regnum)门门 （（Phylum）） (Phylum)纲纲（（Class）） (Classis)目目（（Order）） (Ordo)科科（（Family）） (Familia)属属（（Genus）） (Genus)种种（（Species）） (Species)常用的细菌分类学术语常用的细菌分类学术语：1）培养物）培养物(culture)：：一定时间一定空间内微生物的一定时间一定空间内微生物的细胞群或生长物。

如微生物的斜面培养物、摇瓶培养细胞群或生长物如微生物的斜面培养物、摇瓶培养物等2）菌株）菌株(strain)：：从自然界中分离得到的任何一种微从自然界中分离得到的任何一种微生物的纯培养物都可以称为微生物的一个菌株；对不生物的纯培养物都可以称为微生物的一个菌株；对不同来源的同一种细菌称为该菌的不同菌株同一种细同来源的同一种细菌称为该菌的不同菌株同一种细菌可有许多菌株，其菌可有许多菌株，其主要性状应该完全相同，次要性主要性状应该完全相同，次要性状可稍有差异状可稍有差异，通常用地名或动物名的缩写加编号作，通常用地名或动物名的缩写加编号作菌株名3）型）型(form或或type)：：常指亚种以下的细分当同种或同常指亚种以下的细分当同种或同亚种不同菌株之间的性状差异，不足以分为新的亚种时，可以亚种不同菌株之间的性状差异，不足以分为新的亚种时，可以细分为不同的型如不同血清型、噬菌型等）细分为不同的型如不同血清型、噬菌型等）微生物的种：微生物的种：具有高度特征相似性的菌株群，这个菌株群与其具有高度特征相似性的菌株群，这个菌株群与其 他类群的菌株有很明显的区别他类群的菌株有很明显的区别菌株与型的区别：菌株与型的区别：菌株之间不存在鉴别性特征的差异，命名不同的菌株无需分菌株之间不存在鉴别性特征的差异，命名不同的菌株无需分类学依据，不同型的细菌之间存在鉴别性特征的差异，命名类学依据，不同型的细菌之间存在鉴别性特征的差异，命名或鉴定不同的型必需有分类学依据。

或鉴定不同的型必需有分类学依据4）种（）种（species））： 物种，生物分类中基本的分类单元物种，生物分类中基本的分类单元二、二、细菌的命名细菌的命名 细菌的命名依据细菌的命名依据“国际细菌命名法规国际细菌命名法规” 的规定，的规定，学名用学名用拉丁文拉丁文，遵循，遵循“双名法双名法”所谓“双名法双名法”就是每一种细菌的拉丁文名称由属名和种名两就是每一种细菌的拉丁文名称由属名和种名两部分构成，部分构成，属名第一个字母必须大写，其余均应属名第一个字母必须大写，其余均应小写（即使种名以人名或地名命名）小写（即使种名以人名或地名命名）整个属名整个属名及种名在出版物中应排成斜体及种名在出版物中应排成斜体 如：如：Escherichia coli 属名属名+种名种名 Salmonella pullorum (S. pullorum)•属名重复出现，可缩写属名重复出现，可缩写 如：如：E.coli （大肠杆菌）；（大肠杆菌）； S. pullorum（鸡白痢沙门氏菌）（鸡白痢沙门氏菌）•只确定属名，未确定种名的某一株细菌只确定属名，未确定种名的某一株细菌 Salmonella sp.•只确定属名，未确定种名的若干菌株只确定属名，未确定种名的若干菌株Salmonella spp.•亚种用亚种用subsp.（正体）表示（正体）表示 Pasteurella multocida subsp. septica 几种不同的书写情况：几种不同的书写情况：由于细菌分类单元的划分缺乏一个易于操作的统一标准，由于细菌分类单元的划分缺乏一个易于操作的统一标准，为了减少因采用不同标准界定分类单元所造成的混乱，为了减少因采用不同标准界定分类单元所造成的混乱，细菌系统分类也像其他生物分类一样采用细菌系统分类也像其他生物分类一样采用“模式概念模式概念”种和亚种指定模式菌株（种和亚种指定模式菌株（type strain）；）；亚属和属指定模式种（亚属和属指定模式种（type species）；）；属以上至目级分类单元指定模式属（属以上至目级分类单元指定模式属（type genus）；）；模式菌株应送交菌种保藏机构保藏，以便备查考和索取。

模式菌株应送交菌种保藏机构保藏，以便备查考和索取美国典型培养物保藏中心（美国典型培养物保藏中心（ATCC））德国微生物及细胞保藏中心（德国微生物及细胞保藏中心（DSM））细菌分类命名权威杂志细菌分类命名权威杂志:国际系统与进化微生物学杂国际系统与进化微生物学杂志（志（International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,IJSEM））任何分离鉴定的新细菌的有关论文应在该杂志发表任何分离鉴定的新细菌的有关论文应在该杂志发表二、二、 原核微生物分类系统原核微生物分类系统（一）《伯杰氏鉴定细菌学手册》（一）《伯杰氏鉴定细菌学手册》(Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology)美国宾夕法尼亚大学的细菌学教授伯杰美国宾夕法尼亚大学的细菌学教授伯杰(D.Bergey)(1860-1937)伯杰氏手册伯杰氏手册: 是目前进行细菌分类、鉴定的最重要参考书，是目前进行细菌分类、鉴定的最重要参考书，其特点是描述非常详细，包括对细菌各个属种的特征及进行其特点是描述非常详细，包括对细菌各个属种的特征及进行鉴定所需做的实验的具体方法。

鉴定所需做的实验的具体方法1923年以来已出至第九版年以来已出至第九版(1994)；；第九版伯杰氏细菌鉴定手册设立第九版伯杰氏细菌鉴定手册设立35个群，将古细菌部个群，将古细菌部改编为改编为5个群，全书描写了约个群，全书描写了约500个属划分为四大类：划分为四大类： 第一类第一类 具细胞壁的革兰氏阴性真细菌具细胞壁的革兰氏阴性真细菌 第二类第二类 具细胞壁的革兰氏阳性真细菌具细胞壁的革兰氏阳性真细菌 第三类第三类 无细胞壁的真细菌无细胞壁的真细菌 第四类第四类 古细菌古细菌 伯杰氏细菌鉴定手册伯杰氏细菌鉴定手册（二）伯杰氏系统细菌学手册（二）伯杰氏系统细菌学手册(Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology)第一版第一版 1984年问世，至年问世，至1989年出齐，共年出齐，共4卷第二版第二版 由由George Garrity主编分为主编分为5卷，将从卷，将从2000年起年起陆续出版这一版纳入了研究核糖体陆续出版这一版纳入了研究核糖体RNA测序所产生测序所产生的许发育的许发育)分类系统。

分类系统四、微生物分类鉴定的依据四、微生物分类鉴定的依据 根据微生物分类学中使用的技术和方法，根据微生物分类学中使用的技术和方法，可把它们分成四个不同的水平：可把它们分成四个不同的水平：•①①细胞形态和行为水平；细胞形态和行为水平；•②②细胞组分水平；细胞组分水平；•③③蛋白质水平；蛋白质水平；•④④基因组水平基因组水平•在微生物分类学发展的早期，主要的分类在微生物分类学发展的早期，主要的分类鉴定指标是以在细胞形态和习性为主，可鉴定指标是以在细胞形态和习性为主，可称为经典的分类鉴定法称为经典的分类鉴定法五、微生物分类鉴定的方法五、微生物分类鉴定的方法生物分类的传统指标生物分类的传统指标分子生物学指标分子生物学指标 微型、简便、快速或自动化鉴定技术微型、简便、快速或自动化鉴定技术细菌的数值分类细菌的数值分类 形态学特征形态学特征生理学特征生理学特征生态学特征生态学特征 从不同层次，用不同学科的技术方法来研究和比较从不同层次，用不同学科的技术方法来研究和比较不同微生物的细胞、细胞组分或代谢产物，从中发现的不同微生物的细胞、细胞组分或代谢产物，从中发现的反映微生物类群特征的资料。

反映微生物类群特征的资料生物分类的传统指标生物分类的传统指标一、形态学特征一、形态学特征培养特征、培养特征、运动性、运动性、特殊的细胞结构、特殊的细胞结构、细胞形态及其染色特性、细胞形态及其染色特性、等等等等微生物分类和鉴定的重要依据：微生物分类和鉴定的重要依据：a）易于观察和比较，尤其是真核微生物和具有特殊）易于观察和比较，尤其是真核微生物和具有特殊 形态结构的细菌；形态结构的细菌；b）许多形态学特征依赖于多基因的表达，具有相对）许多形态学特征依赖于多基因的表达，具有相对 的稳定性；的稳定性；二、生理生化特征二、生理生化特征与微生物的酶和调节蛋白质的本质和活性直接相关；与微生物的酶和调节蛋白质的本质和活性直接相关；代谢产物等代谢产物等营养类型；营养类型；与氧的关系；与氧的关系；对温度的适应性；对温度的适应性；对对pH的适应性；的适应性；对渗透压的适应性；对渗透压的适应性；酶及蛋白质都是基因产物；酶及蛋白质都是基因产物；对微生物生理生化特征的比较也是对微生物基因组的间接比较；对微生物生理生化特征的比较也是对微生物基因组的间接比较；测定生理生化特征比直接分析基因组要容易得多测定生理生化特征比直接分析基因组要容易得多；1 1、、 API API 细菌数值鉴定系统细菌数值鉴定系统2 2、、 Enterotube Enterotube 系统系统3 3、、 Biolog Biolog 全自动或手动细菌鉴定系统全自动或手动细菌鉴定系统 微型、简便、快速或自动化鉴定技术微型、简便、快速或自动化鉴定技术1、、 API 细菌数值鉴定系统细菌数值鉴定系统菌种菌种基本培养基基本培养基（液体）（液体） 菌悬液菌悬液检测、编码、查表、鉴定检测、编码、查表、鉴定适用于适用于APIAPI鉴定细鉴定细菌有菌有700700多种多种Analytica Products INC的简称。

法国生物- 梅里埃公司生产的细菌数值分类分析鉴定系统约有1 000 种生化反应,可鉴定的细菌大于550 种目前中国各级疾病预防控制机构在细菌学检验中比较多地应用了此项技术 2、、Enterotube 系统系统 不同培养基分装不同小槽中，同不同培养基分装不同小槽中，同步接种，培养后检测、查表、鉴定步接种，培养后检测、查表、鉴定3 3、、BiologBiolog全自动或手动细菌鉴定系统全自动或手动细菌鉴定系统 在在96孔的细菌培养板上检测微生物对孔的细菌培养板上检测微生物对不同发酵性碳源利用情况进行的分类鉴定不同发酵性碳源利用情况进行的分类鉴定自动化、快速自动化、快速 可鉴定细菌有可鉴定细菌有11401140多种、酵母菌多种、酵母菌267267种、目种、目前已经可用于丝状真菌前已经可用于丝状真菌每个孔中含有每个孔中含有不同的底物不同的底物菌悬液或菌悬液或无菌水无菌水分子生物学指标分子生物学指标 DNA碱基因组成是各种生物一个稳定的特碱基因组成是各种生物一个稳定的特征，即使个别基因突变，碱基组成也不会发生征，即使个别基因突变，碱基组成也不会发生明显变化。

明显变化1. DNA的碱基组成的碱基组成(G+Cmol%) 分类学上，用分类学上，用G+C占全部碱基的分子占全部碱基的分子百分数百分数(G+Cmol%)来表示各类生物的来表示各类生物的DNA碱碱基因组成特征基因组成特征 每个生物种都有特定的每个生物种都有特定的GC%范围，因范围，因此此 可以作为分类鉴定的指标细菌的可以作为分类鉴定的指标细菌的GC%范围为范围为25--75%，变化范围最大，因此更适，变化范围最大，因此更适合于细菌的分类鉴定合于细菌的分类鉴定 GC%测定主要用于对表型特征难区分的细菌测定主要用于对表型特征难区分的细菌 作出鉴定，并可检验表型特征分类的合理性，作出鉴定，并可检验表型特征分类的合理性， 从分子水平上判断物种的亲缘关系从分子水平上判断物种的亲缘关系G+C含量的比较主要用于分类鉴定中的含量的比较主要用于分类鉴定中的否定否定但具有相似但具有相似G+C含量的生物并不一定表明它们含量的生物并不一定表明它们之间具有近的亲缘关系之间具有近的亲缘关系 同一个种内的不同菌株同一个种内的不同菌株G+C含量差别应在含量差别应在4～～5%以下；同属不同种的差别应低于以下；同属不同种的差别应低于10～～15%；； G+C含量已经作为建立新的微生物分类单元的一含量已经作为建立新的微生物分类单元的一项基本特征，它对于种、属甚至科的分类鉴定有重要项基本特征，它对于种、属甚至科的分类鉴定有重要意义。

意义 若二个在形态及生理生化特性方面及其相似的若二个在形态及生理生化特性方面及其相似的菌株，如果其菌株，如果其G+C含量的差别大于含量的差别大于5%，则肯定不是，则肯定不是同一个种，大于同一个种，大于15%则肯定不是同一个属则肯定不是同一个属2. 核酸的分子杂交核酸的分子杂交 不同生物不同生物DNA碱基排列顺序的异同直接反映生物碱基排列顺序的异同直接反映生物之间亲缘关系的远近，碱基排列顺序差异越小，它们之间亲缘关系的远近，碱基排列顺序差异越小，它们之间的亲缘关系就越近，反之亦然之间的亲缘关系就越近，反之亦然t 直接分析比较DNA的碱基排列顺序------由于技术上的困难目前尚难以普遍地进行；由于技术上的困难目前尚难以普遍地进行；t 核酸分子杂交(hybridization)间接比较不同微生物DNA碱基排列顺序的相似性3. 生物信息学分析生物信息学分析 随着微生物基因信息，特别是全基因组随着微生物基因信息，特别是全基因组完全测序的不断增加，我们可以通过各种计完全测序的不断增加，我们可以通过各种计算机软件对不同物种的遗传信息进行直接比算机软件对不同物种的遗传信息进行直接比较，从而分析不同微生物间的亲缘关系。

较，从而分析不同微生物间的亲缘关系4、、16S rRNA和系统发育树和系统发育树(1). 16S rRNA的顺序和进化的顺序和进化培养微生物培养微生物提取、纯化细菌基因组提取、纯化细菌基因组设计引物设计引物PCR扩增扩增16S rRNA分析比较分析比较微生物之间的系统发育关系微生物之间的系统发育关系(2). 特征序列或序列印记（特征序列或序列印记（signature sequence））通过对通过对r RNA全序列资料的分析比较（特别是全序列资料的分析比较（特别是采用计算机）发现的在不同种群水平上的特采用计算机）发现的在不同种群水平上的特异特征性寡核苷酸序列，或异特征性寡核苷酸序列，或在某些特定的序在某些特定的序列位点上出现的单碱基印记列位点上出现的单碱基印记特征序列特征序列有助于有助于迅速确定某种微生物的迅速确定某种微生物的分类归属，或建立新的分类单位分类归属，或建立新的分类单位(3) 系统发育树系统发育树(phylogenetic tree) 通过比较通过比较生物大分子序列差异的数值构生物大分子序列差异的数值构建的系统树称为分子系统树，其特点是建的系统树称为分子系统树，其特点是用一用一种树状分枝的图型来概括各种种树状分枝的图型来概括各种( (类类) )生物之间生物之间的亲缘关的亲缘关系。

系16 S r RNA系统发育树系统发育树建立建立16 S r RNA系统发育树的意义系统发育树的意义a）使生物进化的研究范围真正覆盖所有生物类群；）使生物进化的研究范围真正覆盖所有生物类群；c）对探索生命起源及原始生命的发育进程提供了线索和理论依据；）对探索生命起源及原始生命的发育进程提供了线索和理论依据；d）突破了细菌分类仅靠形态学和生理生化特性的限制，建立了全）突破了细菌分类仅靠形态学和生理生化特性的限制，建立了全 新的分类理论；新的分类理论；e）为微生物生物多样性和微生物生态学研究建立了全新的研究理）为微生物生物多样性和微生物生态学研究建立了全新的研究理 论和研究方法，特别是不经培养直接对生态环境中的微生物进论和研究方法，特别是不经培养直接对生态环境中的微生物进 行研究5、其它、其它血清学试验血清学试验噬菌体分型噬菌体分型生态特性生态特性氨基酸顺序氨基酸顺序蛋白质分析蛋白质分析细胞壁等细胞成分细胞壁等细胞成分 通过原核生物的通过原核生物的转化、转导、接合转化、转导、接合来判断原来判断原核生物的亲缘关系等等核生物的亲缘关系等等。