多糖的分离纯化.ppt

莼菜多糖的分离纯化莼菜多糖的分离纯化PPTPPT制作：丁楚蔚、汪心妍制作：丁楚蔚、汪心妍汇报人：丁楚蔚汇报人：丁楚蔚背景资料：谭晓菁、江淑华背景资料：谭晓菁、江淑华研究背景实验步骤与结果总结与展望目录研究背景1莼菜莼菜•睡莲科，多年生水生草本植物，又名马蹄草，•有调节免疫、抗氧化、抗病毒、抗炎、抗菌、降血糖、￿￿￿降血脂等功效￿，•含酸性多糖、多酚、蛋白质、氨基酸、维生素、组胺及微量元素，•多糖在莼菜干品中所占的比例最高，主要分布于叶底部、茎周围的黏液质中，是莼菜发挥药效的主要物质基础方法流程采用碱提醇沉工艺，经除蛋白、除色素得到莼菜多糖￿(BSP)再 经 DEAE纤维素DE-52柱Sepharose￿CL-6B琼 脂 糖凝胶柱对BSP进行分级精制采用高效凝胶过滤色谱￿(HPGFC)测定BSP各组分的分子量仪器与材料￿￿￿￿￿￿￿仪器￿￿￿￿￿材料Agilent￿1200￿HPLC￿色谱仪AE240￿分析天平UV-2102PC￿紫外可见分光光度计￿￿FD-1C-55￿冻干机旋转蒸发仪超滤仪DZG-6020￿减压干燥箱￿莼菜嫩叶；无水乙醇；￿NaOH；盐酸；木瓜蛋白酶；聚酰胺树脂；￿DEAE￿纤维素￿DE-52；琼脂糖凝胶￿Sepharose￿CL-6B；￿透析袋；蒽酮、硫酸；纯化水粗多糖的提取莼菜粗多糖￿￿￿￿￿￿￿加40倍￿0.￿3￿mol/L￿NaOH￿溶液，70￿℃￿加热搅拌提取￿2￿h，加盐酸中和，过滤，滤液浓缩，加入无水乙醇至￿67%￿，4￿℃静置过夜，4￿500￿r/min￿离心￿20￿min，80%￿乙醇洗涤￿3￿次，沉淀减压干燥，得￿83￿g￿莼菜粗多糖。

除去脂溶性成分￿￿￿￿￿￿￿￿取250g莼菜喷干粉，加无水乙醇2.5￿L，60￿℃￿旋转回流提取2￿h，过滤，重复操作￿1￿次，除去脂溶性成分，滤渣烘干莼菜喷干粉￿￿￿￿￿￿￿新鲜莼菜嫩叶，经清水淋洗、均浆机剪切、喷雾干燥得莼菜喷干粉￿粗多糖纯化01020304酶解灭活脱蛋白￿￿￿粗多糖用￿2.5￿L￿纯化水复溶，加入木瓜蛋白酶，63￿℃￿酶解￿6￿h，灭活过滤除去不溶物，滤液进行第2￿次酶解灭活脱蛋白聚酰胺层析￿￿￿滤液流经预处理的聚酰胺层析柱脱色，滤液与聚酰胺湿填料的体积之比为1∶1，纯化水洗脱，共收集洗脱液￿8￿L滤膜过滤浓缩￿￿￿再用微孔滤膜过滤，滤液用超滤膜超滤浓缩至800mL￿后加入无水乙醇至67%，4￿ ℃￿ 静置过夜后离心，80%￿乙醇洗涤￿3￿次，减压干燥得到BSP￿￿￿￿获得灰白色胶状莼菜多糖￿(BSP)￿22￿g，收率为￿8.￿8%￿BSP含有量测定010203葡萄糖标准曲线制作￿￿￿￿BSP纯度测定精密称取干燥至恒重的BSP￿24.72￿mg￿至￿500mL￿量瓶，纯化水溶解并定容，摇匀，测定样品吸光度为￿0.521，计算可知￿BSP的纯度为￿61.￿89%￿。

￿￿￿￿￿紫外检测粗多糖经木瓜蛋白酶脱蛋白、聚酰胺脱色素等处理后，紫外全波长扫描显示在￿260、280￿nm￿处其吸光度接近于零，表明已除去蛋白质、核酸等杂质利用蒽酮硫酸法：以葡萄糖质量浓度为横坐标￿(X)，吸光度为纵坐标￿(A)得曲线方程￿A￿=￿17.￿294X￿－0.￿0076￿(Ｒ2￿=￿0.￿9994)BSP 精制取10￿g￿BSP，200￿mL￿纯化水充分溶解后过DEDA￿纤维素￿DE-52￿离子交换柱￿(60￿mm￿×￿950￿mm)，依次用0～1.0mol/L￿NaCl￿溶液梯度洗脱，分管收集洗脱液，采用￿“2.￿2”￿项下方法，以洗脱管数为横坐标，多糖浓度为纵坐标绘制洗脱曲线BSP￿经￿DEAE￿纤维素￿DE-52￿分离后，可得￿3￿个峰￿(图￿1)，透析￿(截留分子量￿8￿000￿～￿14￿000)、浓缩、冻干各峰组分，得到￿BSP-1、BSP-2、BSP-3BSP 精制对￿2￿个主要组分￿BSP-1、BSP-3￿用琼脂糖凝胶柱￿Sepharose￿CL-6B￿进一步的分离纯化，用纯化水洗脱，蒽酮-硫酸显色法测定多糖含有量洗脱曲线￿(图￿2)￿表明，莼菜精制多糖￿BSP-1、BSP-3￿组分均一，分别浓缩、冻干￿。

分子量测定￿￿￿￿￿￿￿￿色谱条件:￿色谱柱￿TSK￿gel￿G5000PWxl￿(￿10￿)、￿G4000PWxl￿(￿10￿)、G3000PWxl￿(7)￿(7.￿8￿mm￿×￿300￿mm)￿串联;￿保护柱￿TSKPWxl￿Guard￿column;￿Agilent￿1260￿示差折光检测器;￿流动相为纯化水;￿体积流量0.￿4￿mL/min;￿进样量￿30μL;￿柱￿温30￿℃￿;￿检测器温度￿35￿℃￿;￿环境温度￿25￿℃￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿称取葡聚糖对照品、莼菜多糖各组分样品（BSP1、BSP2、BSP3），分别用纯水溶解并配制成2mg/mL的溶液，过￿0.￿22￿μm微孔滤膜，取续滤液，将图谱数据导入￿GPC软件，建立分子量分布标准曲线，得到分子量对数￿log￿MW与洗脱体积￿VR的线性回归方程￿log￿MW￿=￿10.￿513￿－￿0.￿2377VＲ(r￿=￿0.￿996￿2)，￿￿￿￿￿￿￿￿￿将莼菜多糖各组分导入￿GPC￿软件，调用标准曲线，得出莼菜多糖各组分的Mw、Mn￿和￿D￿等，￿￿结果见表￿1，莼菜多糖的分子量分布为￿(1.￿0507￿～￿1.￿5208)￿×￿106￿Da，分子量较大。

￿￿￿￿图￿3￿显示，高效凝胶渗透色谱图出峰时间单一，可知莼菜多糖各组分均一性良好感谢在座各位聆听感谢在座各位聆听。