TK1检测项目指导手册簿.doc

word第一局部项目运行意义概述胸苷激酶1简称TK1，是一种国际公认的细胞增殖特异性标志物；它参与DNA补救合成途径,是DNA合成的特殊标志酶临床上,可用于监测和评估体内细胞的异常增殖速度健康人细胞多处于静止状态〔非增殖细胞〕，血清中的TK1酶含量极微，而随着增殖类疾病的发生，尤其是肿瘤、组织异常增生类疾病，细胞发生过度增殖，血清中TK1酶的含量出现显著升高，超过健康人平均水平2倍甚至100倍以上所以，通过检测血清中TK1浓度水平的变化，能够敏感地发现细胞增殖异常，动态评估细胞增殖开展趋势，为提前干预治疗高风险癌前病变，遏制肿瘤进程提供重要信息在瑞典卡罗琳斯卡大学(诺贝尔医学和生理学奖评审机构)二十多年的研发根底上,华瑞同康生物技术〔某某〕某某与瑞典Karolinska大学TK1研究团队共同研制出高灵敏度的胸苷激酶1〔TK1〕细胞周期分析试剂盒与CIS系列化学发光数字成像仪，该系统是世界上唯一用于临床检验血清中TK1浓度的产品，其特异性高于95%,对各类增殖性疾病的综合检测灵敏度高于70%该系统已在多临床领域得到较为广泛地应用： 1、独立的肿瘤预后因子：多国家，多机构的研究明确，TK1是优选的预后评估指标，可作为独立的肿瘤预后因子；2、动态评估手术、放化疗效果：能够对各种实体肿瘤〔例如：肺癌，胃癌，结肠癌，直肠癌，食道癌，乳腺癌，宫颈癌，前列腺癌等〕以与白血病和淋巴癌患者的治疗效果进展评估，为治疗方案的改善提供参考；3、更早评估肿瘤复发风险：对肿瘤康复期患者进展动态跟踪，较影像学更早提示肿瘤复发或转移风险信号；4、评估各类增殖类疾病恶变风险：处于过度增殖的增殖类疾病是肿瘤形成的第一步。

基于TK1与细胞增殖的密切关系，能够灵敏地通过TK1的浓度变化，发现恶性增殖风险，为肿瘤的癌前干预提供了更有效率，更有价值的信息，适用于无疾病人群的恶性增殖风险筛查第二局部项目运行准备1、 环境参数温度：24-25℃；湿度：小于65%；实验用水：（1） 双蒸水；（2） 去离子水；2、 实验室设置要求：（1） 项目最小占地约8-9平方米；（2） ××1m工作台；（3） 控温设备：30立方米左右的独立空间，可选用2匹的挂式空调进展控温,或选用恒温摇床，如如下图：二、项目所需设备1、实验用设备编号设备名称规格要求数量用途1化学发光数字成像分析仪CIS系列1采集发光信号和分析数据2脱色/恒温摇床〔平摇〕20-100r/min可调1免疫孵育3台式离心机0-4000r/min1别离血清4冰箱冷藏2-8℃冷冻-20℃1保存试剂保存样本5打印机USB数据接口1输出检测结果6恒温水浴锅单孔或双孔1控制反响液温度 2、实验工具与耗材〔1〕实验用工具：编号工具名称规格要求数量用途1移液器0-10μl或1血清点样2移液器20-100μl1配制反响液3移液器100-1000μl1分装和检测样本4试剂瓶500ml2配制工作液6烧杯100ml2配制工作液7电子计时器无1实验提醒8探头温度计-50℃-50℃1控制实验温度9塑料镊子平头1实验需要10反响盒24T、48T、96T各1适用于对应规格的产品使用11量筒25ml1配制工作液12量筒250ml1配制工作液（3） 实验耗材编号耗材名称规格要求用量用途1移液器枪头20μl1个/样本配套0-10μl移液器使用2移液器枪头200μl2个/次配套20-100μl移液器使用3移液器枪头1ml1个/次配套100-1000μl移液器使用4分装管500μl或1ml1个/样本血清分装时使用5吸水纸无-保持环境清洁，防止膜污染6精细PH试纸-测定缓冲液PH值三、实验样本处理要求与保存样本种类：血清采集要求：1、 必须使用无任何添加剂的真空采血管；2、 取静脉血2ml〔室温〕；3、 建议空腹采血；4、 脂血、溶血样本可能造成实验结果的偏差，不建议使用；样本处理：1、 采血完成后，室温下静置或37℃水浴至凝固后离心使用；2、 离心转速：4000r/min，离心时间：5min；注：室温放置时间不宜超过3h；样本保存：1、 离心后的血清如非即时使用，应立即分装，推荐血清分装量100-200μl/管，放置于-20℃保存；2、 -20℃保存时间以不超过7天为佳；3、 如需长时间保存，建议提高分装量〔1.5ml〕，并放置于-80℃〔可保存3年左右〕；样本运输：1、 样本如需外送检验〔本市X围内或行程小于3小时〕，建议采血后先放置于2-8℃静置，到检验点后取出离心，处理要求同上；2、 样本如需外送检验〔外省市〕，建议离心后分装至分装管中，血清分装量1.5ml/管，运输介质建议使用保温箱+化学冰+干冰，干冰用量 2公斤/24小时〔根据路程消耗时间增量〕；样本复融：1、 血清使用前需充分振荡混匀；2、 冷冻保存的血清样本，需放置于室温完全解冻后使用；3、 反复冻融的血清样本严禁使用。

第三局部项目核心产品简介一、胸苷激酶1细胞周期分析试剂盒注册号：粤食药监械〔准〕字2014第2400369号规格：24人份、48人份、96人份储存条件：2-8℃有效期：6个月〔具体日期见试剂盒标签〕使用要求：某某后一次性使用实验用时：单次实验用时5-6h〔根据样本数量有所差异〕；工作通量：300-400人份/天图1主要组成成份：试剂盒由校准品、抗TK1-IgY、生物素化抗IgY二抗、SA-HRP、ECL1、ECL2、浓缩稀释液、浓缩洗涤液、封闭剂、硝酸纤维素膜主要成分组成组分名称、装量详见产品说明书，并以产品说明书为主二、CIS系列化学发光数字成像分析仪注册号：粤食药监械〔准〕字2011第2400879号1、设备性能参数●系统偏差：±5%●成像灰度等级：12bit(212)●分辨率：1392〔H〕×1040〔L〕●光学镜头：几何形变率小于1%●拍摄X围： 12cm×9cm可调●工作环境温度：10-30℃●单次批处理能力：96人份/次●读出噪音：≤7 e-rms20MHz●降噪能力：专业级高效半导体制冷CCD，集成噪音软处理功能2、主要结构部件 CIS-2化学发光数字成像分析仪、免疫点印迹分析软件、加密狗、Lenovo一体机。

图2第四局部项目实验操作一、项目原理概述1、TK1检测：先将含有TK1抗原血清吸附在硝酸纤维素膜固相载体上，用抗人TK1-IgY抗体识别抗原〔A〕，生物素化抗IgY二抗识别抗原-抗人TK1-IgY抗体并进展信号放大〔B〕，亲和素化辣根过氧化物酶与生物素连接〔C〕，在参加发光底物后，亲和素化辣根过氧化物酶催化底物发光，发出的光信号强弱光信号〔D〕，必须通过CCD的信号采集设备进展采集和分析〔如图3〕图32、实验结果分析：将反响完毕的样本载体，放入暗室〔防止外界光的干扰〕，通过精细的制冷CCD长时间曝光将化学发光强弱信号转变为数字信号，保存后得到样本发光图片，通过校准品固定浓度与亮度的关系，绘制标准曲线，进而计算出其他样本TK1的浓度二、实验操作流程1、实验准备局部：1.1血清准备：请参照《实验样本处理要求与保存》章节；1.2 试剂工作的最优温度为25-26℃，请使用空调和恒温水浴锅等保证实验工作液温度达到该标准；1.3 实验前需仔细清洗玻璃器皿：洗涤液清洗→清水冲洗→实验用水润洗1.4 检测实验用设备和工具是否都处于正常工作状态〔包括化学发光数字成像分析仪〕，对于发现的异常情况进展与时排除；1.5 按照说明书要求配制实验所需的稀释液和洗涤液，保证配制好后的；2、实验操作控制1、 点样：取出点样板，为防止污染在点样板下放一X白纸，样本上样量为 3μl；a.取样后，枪头贴壁2-3次；b.加样枪垂直；c.扶稳加样枪，枪头固定于孔中央；d.保证样本打出后直接被膜吸附；2、 晾干：将膜从点样板中取出，揭掉背面蓝色保护膜，放置于温度28-30℃，湿度小于65%的环境进展晾干，时间为30min；3、 漂洗：待膜晾干完毕，将膜放入反响盒，倒入双蒸水或去离子水，使膜浸没于水中，以60-70r/min的转速洗涤2次，每次1min;4、 封闭：封闭剂使用稀释液配制〔3g封闭剂+50ml稀释液〕；使用磁力搅拌器混匀5min〔或用手快速搅匀10-15min〕，至没有封闭剂颗粒和沉淀为止；将晾干后的膜放入反响盒中，倒入封闭剂；以35-45r/min的转速摇动，时间为30min；5、 抗TK1-IgY抗体反响：将封闭液摇匀〔盒底无沉淀〕后倒出，然后加一抗反响液〔一抗稀释浓度见试剂盒内说明书〕，并以400μl封闭剂/10ml反响液的比例添加封闭剂；以35-45r/min；反响2h；反响液温度控制在25℃左右；6、 洗涤：倒去一抗反响液，先用洗涤液迅速漂洗两次，再倒入洗涤液以60-70r/min的转速洗涤3次，每次5min；7、 生物素化抗IgY二抗：按说明书稀释倍数进展稀释，35-45r/min反响40min；反响液温度控制在25℃左右；8、 洗涤同69、 SA-HRP：按说明书稀释倍数进展稀释， 35-45r/min反响60min；反响液温度控制在25℃左右，10、洗涤同611、ECL发光：取出洗涤好的膜，在吸水纸上控干后放在发光盒中，将ECL1、2液混合后均匀倒在膜上，计时反响1min，反响完成后，立即开始倒计时5min，将膜夹入压膜片中，用滚筒压平，放入化学发光仪中调整位置〔十字交叉中心〕，关闭暗箱门，5min倒计时完毕后进展拍摄。

三、实验结果分析1、工作前准备： 1.1连接好电源，启动设备〔可在拍摄前5min启动〕； 1.2运行免疫点印迹分析软件；在登录界面输入用户、密码后，进入软件操作页面〔异常情况1〕2、实验结果获取流程将实验膜片放入化学发光仪中调整位置〔十字交叉中心〕，关闭样本台；点击工具栏“系统〞——选择“读取CCD〞，或者点击快捷按钮——单击“预拍〞2.2 实验图像的获取：预拍完毕后点击“读取图像〞，即开始读取图像，读取完毕后会弹出“实验图片拍摄完毕，请取出模板〞的提醒〔异常情况2〕，取出膜片后，重新关闭样本台，点击“读取背景图像〞，倒计时完毕后点击“应用〞；点击“应用〞，软件即会对图像自动进展背景扣除并自动压缩显示X围，生成结果图像，点击“关闭〞关闭CCD对话框点击“图像〞——“另存待分析图像〔pwk〕〞，或快捷按钮，选择保存位置保存待分析图像后关闭图像，所保存的文件后缀名为“pwk〞，保存后关闭分析仪电源建议：每天的实验结果建议保存在独立的文件夹，文件夹命名规如此：实验时间+试剂批号，例如：20131212-NT1131101A图43、图像分析操作方法点击“实验〞——“新建实验〞，或快捷按钮，打开新建实验对话框，填写实验名称、报告人、审核人等，点击“确定〞；点击“实验〞——“导入数据〞——“打开待分析图像〞，或直接点击快捷按钮，在弹出的对话框中找到2.4中保存的。