RAPD分子标记技术.ppt

分子标记的类型①基于杂交的分子标记，如RFLP（Restriction fragment length polymorphism,即限制性长度片段多态性）②基于 DNA序列和芯片的分子标记，如SNP（Single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性）③基于 PCR的分子标记，它又分为两类：RAPD （Random amplified polymorphic DNA）DAF（DNA amplification fingerprinting）SSCP（Single strand confirmational polymorphism）小卫星DNA（Minisatellite DNA）微卫星DNA（Microsatellite DNA）,又称SSR（Simple sequence repeat）ISSR（Inter simple sequence repeat）AP-PCR（Arbitrary primer PCR）它主要有SCAR（Sequence characterized amplified region）STS (Sequence tagged site)位点特异的 PCR标记方法多位点标记方法基于PCR技术的DNA扩增方法RAPD标记的原理RAPD标记的操作步骤RAPD标记特点及应用RAPD标记123RAPD标记简介和原理1RAPD标记的操作步骤2（1）随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）简介：RAPD是由Williams和Welsh（1990）同时发展起来的 一项新的建立于PCR实验基础上的检测基因组DNA多态性的遗传标 记技术。

原理：该技术利用大量的、各不相同的，碱基顺序随机排列的寡 聚单核苷酸链为引物(约8～10 个碱基) ，以待研究的基因组DNA片 段为模板，进行PCR扩增扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离，可对基 因组DNA进行多态性分析RAPD标记简介和原理1n RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件，即引物在模板的两条链上有互补位置，且引物3’端相距在一定的长度范围内，就可以扩增出DNA片段n一旦基因组在这些区域发生DAN片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱PCRMelting94 oCMelting94 oCAnnealing Primers 50 oCExtension72 oCTemperature100050T i m e30x5’3’3’5’3’5’5’5’3’ 5’3’5’5’5’5’5’3’3’5’3’5’5’3’5’3’5’RAPDTemplate DNAlPrimer binds to many locations on the template DNA lOnly when primer binding sites are close and oriented in opposite direction so the primers point toward each other will amplification take placeRAPDTemplate DNAPrimers point away from each other, so amplification won’t happenRAPDTemplate DNAPrimers point in the same direction, so amplification won’t happenRAPDTemplate DNAPrimers too far apart, so amplification won’t happen> 2,000 basesTemplate DNAPrimers are just the right distance apart, so fragment is amplified100 - 1,500 basesRAPDMM2 3 4 5 6 7 8 9 10Separated RAPD Fragments4mM MgCl2 1.2 U Taq 5 pM OPA-164mM MgCl2 0.6 U Taq 10 pM OPA-162mM MgCl2 1.2 U Taq 10 pM OPA-16Normal concentrations are shown in yellow text. M = A size standardLowering Magnesium ion concentration results in loss of the largest fragment visible in lanes 2-7RAPD reactions were run in groups of 3 using the same template and primer, but varying Magnesium, polymerase and primer concentrationsWhich variable has the greatest impact on fragment patterns?1.模板DNA的制备与调整根据实验材料的不同，采用相应的DNA提取方 法提取基因组总DNA（gDNA）DNA沉淀经溶解稀 释后琼脂糖凝胶电泳检测OD值，确定提取的质 量和浓度，最后将合格的ＤＮＡ提取液浓度调 整一致，－２０℃保存备用。

RAPD标记的操作步骤22.ＰＣＲ各组分的混配按照反应体系各组分的反应比例，充分、迅速 、有序的添加各种成分，一般家加样顺序：模 板25ng、引物15ng、dNTP0.1mm、10×反应 缓冲液2微升、氯化镁2mm,最后加入Taq酶， 以双蒸水补充体积至25微升，混匀后20微升矿 物油覆盖3.DNA扩增n将盛放以上各组分的离心管放在DNA扩增仪上 按反应程序设定进行DNA扩增，经过35—45个 循环，将ng级的模板DNA扩增到mg级4.扩增产物的分离检测和记录n扩增结束后，采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳对扩 增产物进行分离，电极缓冲液采用1×TAE（ 0.04M Tris-乙酸、0.001M EDTA） 电压80— 100V电泳结束后，凝胶放入0.5%EB染色20 —30min，然后放在中等波长紫外光下观察记 录、照相→→综上，ＲＡＰＤ操作过程概括如下：RAPD标记的主要特点有： （1）不需DNA探针，设计引物无须知道序列信息； （2） DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低 ； （3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等 技术； （4）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子 和纯合子； （5）实验重复性较差，结果可靠性较低。

RAPD标记特点及应用3ＲＡＰＤ标记的应用ＲＡＰＤ标记具有快速、安全、简便、灵敏的 特点，在杂交育种中，尤其在林木果树等多年 生植物的杂交育种中，用于分子标记辅助选择 （MAS）的早期鉴定，从而大大缩短育种年限 ，加速育种进程此外，RAPD已在遗传图谱构建、种质资源分 析、基因标记等方面得到了广泛的应用。