响应面法优化香菇多糖发酵培养基.ppt

响应面分析法优化香菇多糖发酵培养基主要内容n1.香菇多糖与提取方法简介n2.Plackett-Burman设计法与响应面分析法n3.实验材料与方法n4. Plackett-Burman优化培养基实验设计n5.响应面法优化培养基组成n6.结论1.香菇多糖与提取方法简介n香菇多糖：是一种生理活性物质它具有抗病毒、抗 肿瘤、调节免疫功能和刺激干扰素形成等功能n提取方法：从香菇子实体或经深层发酵后的发酵液中 提取香菇子实体生长周期长，产量和多糖得率均较 低而深层发酵培养香菇菌丝体不仅发酵液中含有与 子实体相当或更高的营养物质，同时还可利用农副产 品作原料，成本低，周期短，易于大规模生产，因此 已得到广泛应用于重视但目前香菇菌丝体发酵水平较低，通过优化条件以提 高多糖含量是发酵过程中急需解决的问题2.Plackett-Burman设计法与响应面分析法n同：都是20世纪中叶后发展起来的的优化实验条件的统计 学方法能用较少的实验次数推算出目标值的优化条 件，优化效率高n异：Plackett-Burman试验就是筛选实验设计，主要针对因 子数较多，且未确定众因子相对于相应变量的显著性 ，采用的试验方法。

响应面分析法是一种优化实验条件寻优的方法，它通 过试验设计、建模、检验模型的合适性，寻求最佳组 合条件的众多试验和统计技术本实验优化香菇多糖培养基方法用Plackett-Burman实验设计筛选影响香菇产多糖的主要因素用Box-Behnken实验设计对培养基做响应面分析实验回归模型验证实验，确定最优培养基最陡爬坡法确定因素水平用统计软件SAS8.0进行回归拟合，建立回归模型与方程3.实验材料与方法n3.1菌种来源：香菇135，本实验室分离保存（浙江庆元）n3.2试剂：马铃薯购自农贸市场，鱼粉为浙江工业大学药学院提供 ，其余所需的主要试剂均为分析纯，n3.3培养基与培养方法斜面培养基：采用PDA 培养基种子培养基组成为（%） ：葡萄糖2，蛋白胨0.25，酵母膏0.25，初始pH 自然，121℃灭 菌30min初始发酵培养基成分为（%）：葡萄糖1.5，酵母膏 0.5，MgSO4·7H2O0.1初始pH 5.5，121℃灭菌30min斜面菌种转接至装有100mL 种子培养基的250mL 三角瓶中 ，置回转式摇床180r/min，25℃培养5d然后将菌丝体无菌条件 下打散制成种子悬液，以10%的接种量转接入100mL/250mL的 发酵培养基中，回转式摇床180r/min，25℃培养6d 后结束。

n3.4粗多糖提取将发酵菌悬液离心（4,000r/min，20min），分别收集上清液和菌 体上清液中加入无水乙醇至75%（v/v），冰箱保存过夜，再经离心 （8,000r/min，10min），取沉淀用于胞外多糖测定菌体洗涤后，悬 浮于一定体积的去离子水中， 超声波破壁（300Hz，10min)，高速离 心（10,000r/min，10min）收集上清液，处理过程同上，用于胞内多 糖测定粗多糖为胞内多糖与胞外多糖之和n1.5 粗多糖测定粗多糖含量测定采用苯酚-硫酸法（Dubois et al.1956）4. Plackett-Burman优化培养基实验设计n4.1 Plackett-Burman实验筛选主要影响因子本实验选用N=12的Plackett-Burman实验设计，对葡萄糖（A）、 鱼粉（B）、VB1（C）、NaCl（D）、FeSO4（E）、MgSO4（F）、 KH2PO4（G）和初始pH（H）8个因素进行考察，每个因素取高（+ ）低（-）两个水平，高水平约为低水平的1.25倍，响应值为总 粗多糖产量（Y），实验设计见表1，因素水平取值、效应及显著 性分析见表2表1 Plackett-Burman 实验设计与结果BACK表2 Plackett-Burman 实验分析结果由表可知，在香菇菌株135产多糖过程中葡萄糖、鱼粉和KH2PO4这3个因 素对多糖产量显著，可考虑作为主要因素进一步做响应面实验。

4.2 最陡爬坡实验设计及结果n要得到响应面拟合方程，必须要先逼近最佳值区域而本方法以 实验值的变化方向为爬坡方向，根据各因素效应值大小确定变化 步长根据表2分析结果，确定不显著因素的水平，表现为负效 应的因素取低值水平，正效应的取高值显著因素的变化步长及 方向的实验设计及结果表明（表3），第3组产量最高，因此以第 3组的水平作为响应面实验的中心点，即葡萄糖2%，鱼粉1.0%， KH2PO40.1%0.50.051.5最佳组5.响应面法优化培养基组成n5.1Box-Benhnken实验设计与分析：依据Plackett-Burman实验和最陡爬坡法实验确定的因素与水平 采用Box-Benhnken实验设计对产多糖发酵培养基进行3因素3水平 的响应面分析实验响应面实 验中心点表5 Box-Behnken 实验 设计及相应结果3个中心实验 效果佳5.2二次回归模型拟合和方差分析n利用系统软件SAS8.0对表5实验数据进行二次多项回 归拟合，通过RESEG（响应面回归）过程进行数据分 析，建立二次响应面回归模型，并寻求最优相应因子 水平，得到回归方程：nY=2.136667+0.44625X1+0.045X2-0.01375X3- 0.44583X12-0.13833X22-0.09083X32- 0.1175X1X2+0.015X1X3-0.0725X2X3模型的F检验值在α=0.05时远大于F（9,5）=4.77，说明方程 有很高的显著性。

R2=0.9973，表明方程模型与实验数据有99.73%的符合度，调 整后的R2adj=0.9925，表明方程模型有很高的可信度葡萄糖影响最 为显著多糖开始由X2X3 浓度增加而减少两者相互作用 显著5.3培养基最适组合n在获得非线性回归模型和响应面之后，为了求得培养 基最佳浓度，对所得的回归拟和方程分别对各自的变 量求一阶偏导数，并令其为得到三元一次方程组，求 解此方程组可以得到最大多糖量时的最佳条件：nX1=0.5066(2.2533%) ，X2=-0.0488(0.9756%) ， X3=0.0144(0.0993%) ，Y=2.2487g/L所以产多糖最 高时的培养基组成为：葡萄糖2.2533%，鱼粉 0.9756%，VB1 0.003%，NaCl0.8%，MgSO4·7H2O 0.1%，FeSO4·7H2O 0.04%，KH2PO4 0.0993%，初 始pH值5.5回归模型验证实验n根据最优培养基配方对模型进行验证，香菇菌丝体产 粗多糖为2.33g/L，实际值与预测值的误差为+3.61% 初始培养基条件下总多糖产量为0.80g/L，优化后提 高了1.91倍该结果表明，响应面法优化产香菇粗多 糖最佳培养基是可行有效的。

6.结论n 该研究经响应面方法优化，得出菌株产多糖的最佳培养基配 方为：葡萄糖2.2533%，鱼粉0.9756%，VB1 0.003% ， NaCl 0.8% ，MgSO4·7H2O 0.1% ，FeSO4·7H2O 0.04%，KH2PO4 0.0993%，初始pH值5.5在优化条件下经3批摇瓶培养实验验 证，粗多糖产量均值为2.33g/L与预测值2.2487g/L误差为 +3.61%，与原始培养条件相比，多糖产量提高了1.91倍实验证明响应面方法对培养基优化是非常有效的工具， Plackett-Burman实验设计能对影响多糖产量的各因素效应进行 评价并能有效地找出主要因素，最陡爬坡法能充分接近最大响应 面区域，Box-Behnken实验设计能建立主要因素影响多糖产量的 二次多项数学模型，并利用统计学方法对该模型进行了显著性检 验，优化了内在因素水平，找出最佳值。