超声联合白蛋白微泡造影剂介导的基因靶向转染.pdf

中文摘要式奠定初步的实验基础第一部分超声联合微泡造影剂对大鼠脊斜肌微血管通透性的影响目的研究治疗剂量超声破坏微泡造影剂对大鼠脊斜肌毛细血管通透性的影响方法以伊文思蓝( E v a n sB l u e ，E B ) 为指示剂，1 8 只清洁级S p r a g u e - D a w l e y ( S D )大鼠，随机均分为伊文思蓝组( E ) 、伊文思蓝+ 超声组( E + U ) 和伊文思蓝+ 超声+ 微泡组( E + U + M ) 共3 组进行实验给予相同参数条件的超声进行照射，经颈动脉输／不输入微泡造影剂，应用在体荧光显微镜观察E B 外溢情况并行视觉评分；使用标准曲线和分光光度法测量各组大鼠脊斜肌中E B 的含量结果E + U + M 组镜下可见微血管周围E B 外溢，视觉评分等级为2 级，E 组评分O 级，E + U 组评分0 ·1 级E + U + M 组脊斜肌中E B 含量为( 5 1 ．5 7 4 - 3 ．8 9 ) 烬／g ，显著高于E组【( 2 8 ．9 9 - a ：4 ．6 7 ) ．g ／g 】及E + U 组【( 3 0 ．9 9 4 - 4 ．1 1 ) p g 儋】俨0 ．0 0 0 ) 。

E 组及E + U 组两者相比无显著性差异结论超声介导微泡造影剂破坏可使大鼠脊斜肌组织毛细血管通透性增加，可能是超声微泡造影剂增强基因转染的主要机制之一第二部分超声微泡造影剂介导E G F P 质粒转染大鼠脊斜肌的实验研究目的探讨增强型绿色荧光蛋白质粒( E G F P ) 在大鼠脊斜肌微血管通透性增加的条件下表达的可行性方法Ⅱ硕士学位论文2 0 只清洁级S p r a g u e ．D a w l e y ( S D ) 大鼠，随机均分为裸质粒组( P ) 、质粒+超声组( P + U ) 、质粒+ 微泡组( P + M ) 和质粒+ 超声+ 微泡组( P + U + M ) 共4 组进行实验选择增强绿色荧光蛋白质粒与白蛋白微泡相混合，以超声介导白蛋白微泡破裂的方法对大鼠脊斜肌行基因转染，转染7d 后，荧光显微镜下观察质粒在大鼠脊斜肌组织中的表达情况结果P 、P + M 组大鼠脊斜肌组织中均未见增强型绿色荧光蛋白表达；P + U 组可见少量微弱绿色荧光，荧光强度较P 和P + M 组显著增强( P 0 ．0 5 ) ，而超声破坏微泡造影剂则使渗出到血管外的E B 含量( 5 1 ．5 7 士3 ．8 9 ) 大约为对照组的1 倍，超声破坏微泡造影剂组镜下可见微血管周围E B C [ “ 溢，视觉评分等级为2 级，显著高于对照组( 0 级) 及超声组( 0 ．I 级) ；此外，本实验未观察到脊斜肌组织微血管的破裂、出血点和瘀斑，本研究证明了超声联合微泡经皮致大鼠脊斜肌毛细血管内皮屏障通透性的增加，但此种程度的血管通透性增加，能否使外源大分子基1 6硕士学位论文因顺利进入血管外靶组织表达还有待更多、更深入的实验证实。

若能优化条件，如增大超声照射强度、微泡造影剂浓度等，超声介导微泡造影剂经皮照射将可能导致更多微循环通透性的增加，甚至微血管的破裂，这种效应有可能使基因等大分子物质更容易通过毛细血管内皮间隙到达靶组织表达从而更好的发挥基因治疗作用，同时对局部微循环损伤程度的影响也需要更多的研究去验证，如何选择最佳的作用参数条件，在安全的基础上尽可能提高转染的效率，实现最佳的基因表达效果，值得下一步更深入的研究1 7笫二部分超声微泡造影剂介导E G F P 质粒转染大鼠脊斜肌的实验研究第二部分超声微泡造影剂介导E G F P 质粒转染大鼠脊斜肌的实验研究相对于病毒转染的种种弊端，非病毒基因转染是当前基因治疗学研究中不断进展的一个领域而超声微泡造影剂介导的血管内基因传输系统则是该领域中最为活跃的研究热点：将表面粘附或内部包裹有目的基因的超声造影剂经静脉注射后，在靶组织给予一定条件的超声照射，可明显提高体内局部组织的基因转染和表达鉴于当前大多数学者倾向于认为的超声联合微泡造成的微血管破裂是实现血管内基因传输必需条件的论调，本实验拟采用前期实验已证实的仅可造成微血管通透性增加的实验条件，以增强型绿色荧光蛋白质粒为报告基因、大鼠骨骼肌为研究对象，旨在探讨仅在微血管通透性增加的情况下，外源基因在靶组织中表达的可行性。

为临床实现高效、定向和安全的基因治疗奠定更多的理论基础和实践经验材料与方法1 材料1 ．1 实验动物：S p r a g u e - D a w l e y ( S D ) 大鼠2 0 只，雌雄不拘，1 7 0 ．1 9 0 9 ，由南方医科大学动物中心提供1 ．2 实验试剂：乌拉坦( u r e t h a n e ) ：S i g m aC h e m i c a lC m氯醛糖( c h l o r a l o s e ) ：S i g m aC h e m i c a lC o ；K r e b ’S 液：氯化钠3 8 ．5g ，氯化钾1 ．7 5g ，无水氯化钙1 ．1g ，七水硫酸镁：1 ．5g ，葡萄糖：1 0g 溶于5 0 0 0m l 双蒸水，3 7 ℃下用碳酸氢钠调整p H 值为7 ．4 ：5 ％二氧化碳和9 5 ％氮气混合气体：微泡造影剂：南方医科大学南方医院药学部提供的5 ％白蛋白全氟丙烷微球注射1 8硕士学位论文剂( 全氟显) ，微泡直径约为2 - 4l a m ，浓度( O ．8 —1 ．8 ) ×1 0 9 个／m l 实验时以0 ．9％生理盐水3m l 溶解并摇匀后使用。

质粒大量提取试剂盒：Q I A G E N 公司胰蛋白胨，酵母提取物，N a C l ：由南方医科大学病理生理教研室提供抗生素( 青霉素和硫酸链霉素) ：华北制药厂配制好的培养液用前加入10 0U ／m l青霉素和1 0 0U ／m l 硫酸链霉素1 ．3 实验设备器械电热恒温摇床：H Z ．9 2 11 K 恒温振荡器太仓市科教器材厂4 ℃电冰箱：B C D ．2 0 8 K ／AN C J N 青岛海尔股份有限公司．8 0 ℃超低温冰箱：F o r m a - 8 6 C U L TF r e e z e r ，M D F ．1 9 2 三洋低温冰箱离心机：e p p e n d o f f C e n t r i f u g e5 8 1 0 R 低温离心机余实验设备及器械同第一章2 方法2 ．1 实验流程1 9第二鄙分趣声微泡造影荆介导E G F P 质粒转染大鼠脊斜肌的实验研究硕士学位论文2 ．2 实验方法与监测指标2 ．2 ．1E G F P 质粒抽提A ．L B 培养基的配制胰蛋白胨1 0g ，酵母提取物5g ，N a C l1 0g ，溶于1 0 0 0m l d d H 2 0 中，调节p H 为7 ．0 ．7 ．2 。

高温灭菌，4 ℃保存临用前加入氨苄青霉素1 0 0v u g ／V l ：I l l ，即成为L B B ．感受态细菌的制各从D H S a 的L B 固体培养基中挑选单个菌落接种于L B 液体培养基中，3 7 ℃振摇过夜，1m l 过夜培养液加5 0 m IL B 液体培养基振摇，至O D6 0 0I l m 值达到0 ．4 - 4 ) ．6 时离心去上清，加C a C L 2 悬浮细菌沉淀，冰浴再次离心去上清，C a C L 2重悬沉淀，4 ℃冰箱放置过夜；在5m l 感受态细菌里加入1 4 0 山D M S O ，旋转混匀，冰浴1 5m i l l ，再加入同体积的D M S O 后，立即冰浴分装放．7 0 ℃冻存或用于转化C ．质粒转化与扩增取2 0 0p l 新鲜制备的感受态细菌D H 5 a ，加入E G F P 质粒D N A1 —2p l ( 约1 0n g ) 混匀后冰浴，3 7 ℃水浴热休克，再冰浴，加L B3 7 ℃水浴振摇培养，离心弃上清取1 0 0 ～2 0 0 山转化细菌，涂布于含氨苄青霉素( 1 0 0g g ／n 以) 的L B 选择性固体培基上，3 7 “ C 5 ％C 0 2 恒温培养，2 ¨8h 后，观察菌落生长情况。

挑取质粒转化阳性菌落接种于3m lL B 选择性液体培养基中，3 7 ℃震荡培养过夜D ．质粒抽提：采用Q I A G E N 公司生产的质粒大量抽提试剂盒，操作如下：( 1 ) 取1 2 0r a l 在L B 培养基中培养过夜的高拷贝数质粒菌液，之3 ，0 0 0 x g 离心1 0m i n ，弃上清将离心管倒置于纸巾上数分钟，除尽上清 2 ) 用1 0 砌已加入R N a s eA 的B u f f e rS 1 悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应有小的菌块 3 ) 加1 0m lB u f f e rS 2 ，温和并充分地上下翻转8 ．1 0 次混合均匀使菌体充分解，直至形成透亮的溶液；此步骤不宜超过5m i n 2 lg _ - 部分超声微泡造影剂介导E G F P 质粒转染大鼠脊斜肌的实验研究( 4 ) 加入1 0m l4 0 c 预冷的B u f f e rS 3 K ，温和并充分地上下翻转1 0 ．1 2 次混合均匀，直至形成紧实的凝集块；室温放置5m i n 5 ) 加入1 0m l4 “ C 预冷的B u f f e rB ，温和并充分地上下翻转1 0 ．1 2 次混合均匀；1 0 ，0 0 0 x g 离心( 4 0 C ) 1 0m i n 。

6 ) 正确连接负压装置，将大量D N A 制备管插到负压装置的插口上 ”吸取步骤5 中的混合液，转移到大量滤器中，插入注射器芯，垂直向下缓推注至大量D N A 制备管中，开启并调节负压至．2 5 ．3 0 英寸汞柱，缓慢吸尽管中溶液 8 ) 保持负压，加1 2m lB u f f e rW 1 ，吸尽管中溶液 9 ) 加1 4m lB u f f e rW 2 ，吸尽管中溶液Q 0 ) 将大量D N A 制备管置于5 0n l l 离心管中，加4m lB u f f e rW 2 溶液，芝6 ，0 x g离心5m i n O D 将大量D N A 制备管置于洁净的5 0m l 离心管中，在D N A 制备管的基质上加l m lE l u e n t ，室温静置5m i n ≥6 ，0 0 0 x g 离心5m i n 收集质粒D N A Q 乃各取样品2u l ，用T E 溶液稀释5 0 0 倍后用紫外线分光光度计A 2 6 0 ／2 8 0定量，冻真空干燥调整E G F P 质粒浓度为6 0 0 ¨g ／“2 ．2 ．2 质粒与微泡混合液的配制( 1 ) 全氟显微泡声学造影剂1 安瓿，一次性注射器吸取3 面生理盐水，经酒精消毒后的瓶盖注入安瓿瓶内，充分摇匀备用。

2 ) 吸E G F P 质粒溶液( 质粒浓度6 0 0I ．t g ／m 1 ) lm l ，将其加入上述含3m l 全氟显微泡声学造影剂的安瓿瓶内，摇匀后4 “ C 下静置3 0m i n 使E G F P 质粒充分粘附于微泡的外壳 由于质粒带大量负电荷，而微泡的白蛋白外壳带正电荷，质粒便因静电吸引而粘附在微泡表面【2 9 】)该E G F P 质粒与微泡造影剂混合液，微泡浓度约为( O ．8 ．1 ．8 ) x 1 0 9 个／m l ，每4I n J 混合液内含E G F P 质粒6 0 0g g 2 ．2 ．3 实验分组硕士学位论文S D 大鼠2 0 只，随机分为裸质粒组( P ) 、质粒+ 微泡组( P + M ) 、质粒+ 超声组( 升- U ) 和质粒+ 微泡+ 超声照射组( P + M + U ) 共4 组，每组5 只大鼠均同第一章常规麻醉、脱毛，行左侧股静脉插管2 ．2 ．4 超声照射方式：超声探头垂直紧贴大鼠左侧已行脱毛处理的脊斜肌处，探头与皮肤之间以耦合剂密闭，超声参数调整为发射频率lM H z 、声强1 ．5W ／c m 2 、脉冲照射该。