鱼类染色体制备方法概述.docx

    鱼类染色体制备方法概述    黎玉元 孙念 李 伟 李 迪何美凤（湖南农业大学水生生物学实验室长沙410128）Reference：染色体是遗传物质的主要载体，几乎所有的染色体研究都离不开染色体标本的制备，随着各种生物技术的不断发展，鱼类染色体制备方法也不断完善，本文主要介绍鱼类几种主要的染色体制备方法Keys：鱼类；染色体；制备染色体(Chromosome)是细胞的生命形式所携带的DNA结构，是遗传物质的主要载体生物体细胞中的染色体数目和结构是该生物重要的遗传标志之一，在真核细胞中更是如此在自然界中，每个物种的细胞中都存在一定数量、大小、形状的染色体，不同物种的染色体都有各自特定的形态结构（包括染色体的长度、臂比、着丝点位置等）特征，即不同物种的染色体组型特征不一样因此染色体研究对认识和了解生物遗传组成、遗传变异规律和物种起源、进化及种族关系具有重要的科学意义随着染色体技术的飞速发展，染色体技术在鱼类遗传育种中的应用越来越广泛，如对鱼类进行核型分析、荧光原位杂交、基因定位等，然而这些染色体研究技术都离不开染色体标本的制备鱼类染色体标本制备的基本原理是使用化学试剂（秋水仙素）破坏纺锤体，使分裂的细胞处于有丝分裂中期，染色体破膜后平铺在玻片上。

鱼类染色体具有数目多、形态小、分裂指数低的特点，制备大量分裂相且染色体图像清晰的片子较难，这就给鱼类染色体研究带来了诸多不便，加大了鱼类染色体的研究难度但随着各种生物技术的不断发展，鱼类染色体的制备方法也不断完善，这就使得鱼类染色体的研究难度有所降低本文主要介绍鱼类几种主要的染色体制备方法，希望对从事鱼类染色体研究工作者有所帮助1．鱼类染色体标本制备方法目前鱼类染色体标本的制备主要有以下3种方法1.1头肾-PHA注射法头肾-PHA注射法是由山西大学生物系的林义浩先生[6]最早报道的，这是一种快速简捷的染色体制备方法，自报道以来一直被业内学者所借鉴，具体实验步骤如下：1.1.1 注射PHA和秋水仙素实验前1天按质量比lOug/g鱼体重注射PHA（植物血球凝集素），注射部位为实验鱼的胸鳍基部，12小时后，按8ug/g鱼体重再次注射PHA,4小时后，按2ug/g鱼体重在实验鱼胸鳍基部注射秋水仙素1.1.2取材注射秋水仙素1.5-2小时后，将实验鱼断尾及鳃部动脉在水中放血10分钟，取出实验鱼头肾放人盛有生理盐水(0.8% NaCl)的培养皿中清洗2-3遍，然后再将其置于盛有少量的生理盐水的培养皿中，用小剪刀将其剪碎，再将其转移到10ml离心管中并用吸管反复吹打，再吸人一些生理盐水至10ml,混合均匀，静置5分钟后取上层细胞悬液8ml至另一离心管，离心(1000r/min) 10min，弃上清，再重复用生理盐水洗涤2次，目的是为了除去残余的血块和脂肪组织。

1.1.3低渗和预固定将上述离心后的细胞沉淀加入0.075M KCl8ml,吹打均匀，25℃左右低渗30min，低渗完后加入0.5-1ml卡诺氏固定液（冰醋酸：甲醇体积比为1:3,现配现用）吹打均匀，离心(1000r/min) 8min，弃上清1.1.4固定在上述离心后的细胞沉淀中加入4ml卡诺氏固定液混合均匀，固定30min，离心(1000r/min)5min，弃上清，再重复固定1次即可1.1.5制备细胞悬液和滴片将上述离心后的细胞沉淀加固定液(冰醋酸：甲醇的体积比为1:2)1ml左右（固定液应视材料多少而定，切忌过多），混合均匀制成细胞悬液，取干净冷冻玻片，玻片成45度角，在离玻片30cm以上的高度滴2-3滴细胞悬液于载玻片上，自然干燥1.1.6染色和镜检用pH 6.8的PBS（磷酸缓冲液）将吉姆萨母液按9:1稀释，配成工作液（现配现用），室温下染色30min后，吸去染液，用自来水轻轻冲洗，自然干燥，再用显微镜观察、拍照1.2外周血培养法参考吴政安方法，实验步骤如下：1.2.1培养基的准备RPMI1640全培养基[RPMI1640培养基（加少量HEPES,适当调整二者比列，使培养基的pH在7.2左右），20%胎牛血清，植物血球凝集素(PHA)，1%青霉素一链霉素(10000U/ml)]。

1.2.2采血接种用1ml一次性注射器吸取1%的肝素钠溶液0.1ml湿润针管，用75%的酒精对鱼体进行消毒处理，自尾静脉采全血0.1ml,无菌接种于4ml的全培养基内1.2.3培养条件的确定培养条件主要包括培养时间、培养温度和秋水仙素浓度及其处理时间培养时间一般为72小时，培养温度需根据实验鱼的最适生长温度去摸索，半滑舌鳎最适生长温度为14℃-24℃，其血细胞培养温度为24℃；花鲈的最适生长温度为16℃-27℃，其血细胞培养温度为26℃；鲤鱼的最适生长温度为15C-30℃，其血细胞培养温度为28℃秋水仙素的浓度和处理时间与分裂相的多少和染色体的长短有密切关系浓度过高，染色体臂过于浓缩；浓度过低，分裂相较少早前的报道已经摸索出的有：牙鲆在细胞终止培养前4h加入终浓度为1.5ug/ml的秋水仙素效果最好；半滑舌鳎在细胞终止培养前3h加入终浓度为0.08ug/ml的秋水仙素效果最好：花鲈在细胞终止培养前4h加入终浓度为Sug/ml的秋水仙素效果最好；鲤鱼在细胞终止培养前16h加终浓度为0.2ug/ml的秋水仙素效果最好1.2.4培养细胞的收集及制片终止培养时，首先将细胞轻轻吹打，然后将所有的细胞悬液倒人离心管中，并用少量的生理盐水清洗，将培养瓶内残余的细胞洗出倒人离心管中，以1000r/min离心5min，弃去上清液，仅留0.5ml上清液和细胞沉淀。

低渗、预固定、固定、细胞悬液制备、滴片、染色和镜检与PHA-头肾方法一致1.3小鱼游泳法按照张四明方法操作，具体方法如下：1.3.1前处理将幼鱼放在含有0.01%秋水仙素溶液的容器中充气培养6h（溶液可以用海水配制，也可以用淡水配制，自来水需曝气处理）1.3.2取材、低渗将实验鱼断尾放血20分钟左右，将其杀死，并小心地取下腮丝，将其放人75mmol/L KCl低渗液中低渗30-35min1.3.3固定低渗完将其转入甲醇与冰醋酸体积比9:1的固定液中处理8min,再转入100%的冰醋酸中处理1-2min．再将其放人新鲜配制的卡诺氏固定液中固定2次，每次lh,固定完毕后，可将其放人4℃冰箱过夜1.3.4制片、染色、镜检制片前，将固定过的腮丝放人50%的冰醋酸中处理8min．再用镊子轻轻抖动腮丝，使细胞从腮丝上脱落，丢弃腮弓腮丝，液体则为细胞悬液吸取细胞悬液，滴2-3滴到50℃左右的载玻片上，待其自然干燥后再进行常规的吉姆萨染色、镜检2．讨论鱼类染色体制备方法不止以上介绍的三种，除此之外还有组织浸泡法、肾细胞培养法、鳞片培养法、胚胎干细胞培养法、头肾-PHA注射-淋巴细胞富集法等详细介绍以上三种方法，是因为它们比较常用，而且极具代表性，头肾-PHA注射法是直接染色体制片法的典型代表，外周血培养法是细胞培养法的典型代表，小鱼游泳法则是针对幼鱼染色体制备方法的典型代表。

头肾-PHA注射法的优点是操作方便、容易掌握、能够快速得到高质量的染色体片子，缺点是需要杀鱼，不利于鱼的保存及进一步研究工作的开展：外周血培养法的优点是不需杀鱼，有利于鱼种质资源的保存，可获得高质量的染色体片子，缺点是过小的鱼不易采血，细胞培养条件高、培养难度大，不易掌握：小鱼游泳法的优点是能够在野外条件下制备小型鱼类及幼鱼的染色体，且操作简单，缺点是适用范围窄，只能用于2cm以下规格鱼的染色体制备鱼类染色体制备方法虽多，但不论使用哪种方法，都必须注意以下几点：(1)染色体制备前获取生命活动旺盛、分裂增生较快的组织器官是成功制备染色体的基本前提，目前，鱼类染色体制备所用的组织主要有肾、血液、鳍条、腮丝、胚胎等2)PHA的使用剂量及处理温度对实验结果影响显著据文献报道PHA的剂量在8-10ug/g鱼体重这个范围内是安全的，超过20ug/g鱼体重则会导致某些鱼类的死亡，鱼类为冷血脊椎动物．PHA处理最佳温度应控制在25℃-33℃3)把好低渗关，低渗环节很重要，低渗液一般用75mmol/L KCl,低渗最佳处理时间在20-30min左右，低渗过度，容易造成染色体丢失，低渗不足，则很难获得良好的染色体分裂相。

4)秋水仙素的浓度和处理时间是适度，因为秋水仙素的浓度和处理时间与分裂相的多少和染色体的长短有密切关系浓度过高，染色体臂过于浓缩；浓度过低，分裂相较少另外在低渗结束前一定要加1ml左右的卡诺氏对细胞进行预固定[来自www.lW]，这样有助于细胞分散，提高制片质量总之，在制备鱼类染色体时，一定要从实际出发，根据实验目的及实验材料来确定最佳实验方案，这样有利于实验成功Reference（略）  -全文完-。