响应面法优化白地霉发酵麻疯树饼粕产蛋白质饲料工艺条...doc

响应面法优化白地霉发酵麻疯树饼粕产蛋白质饲料工艺条..周剑丽 胡建锋 陈秀勇 牛晓娟 邱树毅麻疯树为大戟科麻疯树属植物，是一种抗旱耐脊的速生树种，在我国集中分布在云贵高原南部的干旱地区．随着利用麻疯树果生产生物柴油的扩大化和规模化．其榨油后的饼粕生产量也逐渐增大开展对麻疯树饼粕的资源化利用研究，采用微生物发酵麻疯树饼粕生产蛋白质饲料对于弥补我国蛋白质饲料短缺具有重要意义本文通过测定培养基中氨态氮的含量(am-moniacal nitrogen content，ANC)作为考察麻疯树饼粕发酵产蛋白质饲料工艺指标在考察温度、时间、pH、接种量、初始加水量及发酵过程中翻曲不翻曲这 6 个因素对培养基中氨态氮含量的影响后．利用 Minitab 软件设计 Plackett-Burman 筛选试验筛选出显著性影响因素通过最陡爬坡逼近氨态氮产量最大响应区后，利用响应面中心组合设计对显著性影响因素进行优化1 材料与方法1．1 试验材料麻疯树饼粕贵州省兴义康达生物能源科技有限公司提供，粉碎，过 40 目筛菌株，白地霉(Geotrichum candidum)，CICC31256，中国工业微生物菌种保藏中心。

1．2 培养基 PDA 斜面培养基；PDA 液体培养基1．3 仪器 万能粉碎机、生化培养箱、pHS-3C 精密酸度计、烘箱、无菌操作台、722s 分光光度计、水浴恒温振荡器、灭菌锅1．4 试验方法1．4．1 菌悬液的制备在无菌操作台中用无菌水将菌种洗脱到 PDA 液体培养基中，30℃，l50 r／min，培养 48 h1．4．2 麻疯树饼粕固体培养基的制备粉碎麻疯树饼粕．过 40 目筛，称取一定量麻疯树饼粕粉，加水调制0．1 MPa，121．6℃，灭菌 20 min1．4．3 氨态氮的测定 甲醛法(王福荣，2006)1．4．4 可溶性蛋白质的测定考马斯亮蓝染色法(王福荣．2006)1．5 发酵条件优化用 Minitabl5 软件设计 6 因素 2 水平的 Plackett-Burman(PB)筛选试验设计，再用中心组合试验设计(central composite design，CCD)和响应曲面(response surfaee methodology，RSM)分析模块对重要因素的水平进行优化2 结果与分析2．1 单因子试验2．1．1 最适培养时间 分别选择发酵周期为 1、2、3、4、5、6 d，30℃下培养，发酵结束后测氨态氮和可溶性蛋白质含量，结果见图 l。

由图 1 可知，第 1～3 天培养基中氨态氮和可溶性蛋白质产量增长最快．第 4 天培养基中氨态氮和可溶性蛋白质含量均达最大值．4 d 后氨态氮和可溶性蛋白质含量趋于平稳．故选择 4 d 为最适培养时间2．1．2 最适培养温度 分别选择 26、28、30、32、34℃作为培养温度，发酵 4 d，测培养基中氨态氮含量，见图 2由图 2 可知，30℃下，培养基中氨态氮含量较其他组高故选择 30℃为最适培养温度2．1．3 最适 pH 值麻疯树饼粕培养基初始自然 pH 值为 5．8，分别调配初始 pH 值为 5．4、6．2 以及自然 pH 值的培养基，每天取样测培养基中氨态氮含量，结果见图 3由图 3 可知，自然 pH 条件下．氨态氮产量在第 3 天达到最大值：pH 为 5．4和 6．2 条件下，氨态氮产量在第 5 天达到最大值虽然 pH 值为 5．4 条件下．氨态氮最高产量较自然 pH 条件下略高，但综合考虑实际操作的便捷性及发酵周期，选择自然 pH 值为最适 pH 值2．1．4 最适初始料水比 调制初始加水量分别为50％、70％、90％、ll0％、l30％的培养基，发酵结束取样测培养基中氨态氮含量，结果见图 4。

初始加水量为 90％和 ll0％时．培养基中氨态氮含量均较高两者相差不明显，其中初始加水量为 90％时，培养基中氨态氮含量最高(为 76．62 mg/g),故选择 90％为最适初始加水量2．1．5 翻曲不翻曲 对比翻曲和不翻曲对发酵过程中氨态氮含量的影响．一组试验不翻曲对照组每 24 h 翻曲 l 次．发酵 4 d 后测培养基中氨态氮含量，结果见图 5任何初始加水量的试验组，翻曲较不翻曲培养基中氨态氮含量高，翻曲有利于菌和培养基的充分接触，增加培养基中的溶氧量．故选择在发酵过程中翻曲2．1．6 最适接种量分别选择 30％、40％、50％、60％、70％(v／m)的接种量，发酵 4 d 后测培养基中氨态氮和可溶性蛋白质含量，结果见图 6接种量为 50％，氨态氮和可溶性蛋白质含量较其他组高，故选择 50％(v／m)为最佳接种量2．2 Plackett-Berman 设计筛选影响氨态氮产量的显著性因素影响氨态氮产量的因素有培养温度、时间、pH 值、接种量、翻曲不翻曲等为对这 5 个因素进行全面考察，选用 n=12 的 Plaekett-Bur-man 设计，并设 1 个空白项作为误差分析项(刘建忠等，2002)。

每个因素取高(+1)低(-1)两个水平运用 Minitabl5 软件分别计算个因素的效应，并对个因素效应进行 t 检验，选择置信度大于 95％的因素作为显著因素进一步考察Plackett-Burman 设计及试验测得的氨态氮结果见表 l各因素的系数估计和效应评价见表 2由表 2 可知，对白地霉发酵纯麻疯树饼粕产氨态氮有显著影响(置信度大于 95％，P<0．05)的因素有温度、初始加水量及翻曲不翻曲，其中，翻曲不翻曲和初始加水量 2 个因素极显著(P<0．01)．且 3 个因素对产氨态氮呈现出正效应(代文亮等，2007)2．3 最陡爬坡(Steepest ascent)试验确定响应面试验因素水平的中心点响应面拟合方程只有在考察的临近区域里才能较好地反映真实情形，所以．应先逼近最大氨态氮产量区域后再建立有效的拟合方程根据 Plackett-Burman 设计筛选出的显著因素及效应设定其步长，以试验变化的梯度方向为爬坡方向，进行最陡爬坡试验设计，能最快、经济地逼近最大氨态氮产量区(Li 等，2007)由 Plaekett-Burman 试验结果表明，3 个显著性影响因子均呈正效应，应增加(熊智强等，2006)。

由于翻曲不翻曲因素属于定性因素，因而不在中心组合设计中考虑该因素因为该因素对产氨态氮起较大的正效应，因而选择整个发酵过程中翻曲温度和初始加水量的步长依次取+1、+5最陡爬坡试验设计及结果见表 3最大氨态氮产量区在第 3 次试验附近，故以试验 3 的条件为响应面试验因素水平的中心点，响应面试验因素水平见表 3响应面设计的因素水平设置见表 42．4 响应面(central composite design)设计确定显著因素的最优水平 逼近最大氨态氮产量区后，进行响应面中心组合试验设计，以试验结果拟合建立描述响应量(氨态氮产量)与自变量(影响氨态氮产量的显著性因素)关系的多项式回归模型，运用 Minitabl5 软件程序对试验数据进行回归拟合．并对拟合方程做显著性检验及方差分析再对拟合方程进行规范形分析，寻找回归模型的稳定点．得到最大氨态氮产量时显著因素的最优水平2 因素 5 水平的响应面中心组合试验设计及试验测得的氨态氮含量结果见表 52．4．1 回归模型的建立及置信度分析 由 Minitabl5 软件拟合得多项式回归模型为：Y=86．52—3．03A—1．52B+2．59AB 一 7．46A 2-3．68B2。

回归方程系数的估计见表 6，方差分析见表 7由表 6 和表 7 可知，回归方程的一次项、二次项系数和均方差较大．交互项的系数和均方差较小．说明两个因素之间交互效应较小在 α=0．0001 水平上．该模型失拟不显著，回归高度显著决定系数(R2)=98．63％，表明 98．63％的氨态氮产量变化可由此模型解释，与实际情况拟合很好该方程为白地霉发酵麻疯树饼粕产蛋白质饲料提供了一个合适的模型，因此可用上述模型代替真实试验点对白地霉发酵麻疯树的饼粕产蛋白质饲料进行分析和预测温度和初始加水量影响氨态氮产量的响应图和等高线图见图 72．4．2 显著因素水平的优化运用 Minitabl5 对回归模型进行规范性分析．寻求最大氨态氮产量的稳定点及对应的因素水平．结合图 7 给出的回归方程的三维响应面图和等高线图可知，回归模型存在稳定点(0.0，0．01030)，对应的 A、B 实际取值为(30，100)，Y 的最大估计值为 86．5即当温度为 30℃，初始加水量为 l00％时，该模型的预测的最高氨态氮产量为 86．5 mg／g，而实际发酵氨态氮产量为 85．6 mg／g，进一步说明该模型能够较好地预测实际发酵情况。

3 结论优化后的白地霉发酵麻疯树饼粕产氨态氮的最佳工艺条件为：发酵周期为 4 d，自然初始 pH 值，30℃，接种量为 50％(v／m)，每 24 h 翻曲 l 次，初始加水量为l00％摘自《中国饲料》.-2009，（5）.-37~44。