利用生物合成原理寻找微生物新药-2.ppt

第三章 利用生物合成原理 寻找微生物新药,根据微生物药物的生物合成原理 发现微生物新药的方法和途径,通过非基因定向改变、基因定向改变，以及组合生物催化的技术，或是改变原有微生物药物的生物合成途径，或是对原有的微生物药物（或先导化合物和中间体）进行生物催化，以发现微生物新药 .,定向与杂交生物合成,化学修饰,微生物药物生物合成 与微生物新药发现的基本途径,通过非基因定向改变的方法包括：定向生物合成、杂交生物合成、突变生物合成，以及生物转化与组合生物转化； 基因定向改变，即为组合生物合成第一节 生物合成途径的非基因定向改变 与微生物新药的发现,一、非遗传操作的定向生物合成 与微生物新药的发现,已有的研究表明，在抗生素等次级代谢产物生物合成中酶－底物的特异性足以使结构相关的代谢产物在其发酵液中积累； 但由于生物合成酶的底物专一性较低（宽泛性），其野生型菌株或阻断突变株的发酵过程中添加一些已知结构类似物作为前体物质，可以产生含有与这种已知结构类似的新衍生物； 这种获得新次级代谢产物的途径，可以被称之为非遗传操作的定向生物合成 (directed biosynthesis)前体（precursor）,即在微生物培养过程中，外源添加的某一化学物质，通过微生物的代谢，能够将其整体地或部分地整合到某一特定的次级代谢产物的分子中去的化合物，如苯乙酸或苯乙酰胺及苯氧乙酸等）。

非遗传操作的定向生物合成,这种在发酵过程中通过添加某种特定的前体物质，使微生物的生物合成朝着将这些前体物质掺入到产物分子的某一特定部位而产生过量的含有这种前体的产物的方法，即为非遗传操作的定向生物合成 其基本原理是由于参与这些反应的生物合成酶的底物专一性较差，而能使外源添加的某些前体物质竞争性地掺入到特定产物的分子中去定向生物合成与微生物新药的发现,次级代谢产物合成酶的特点： 是一个由一系列酶参与催化的多酶体系 参与催化反应的酶的底物专一性比初级代谢合成酶要差应用实例,应用非遗传操作定向生物合成的方法能够制备获得许多新的抗生素，其中目前已进行工业化生产的有： 青霉素G和V； 培罗霉素； 四环素和金霉素等青霉素定向生物合成,培罗霉素定向生物合成,.,培罗霉素定向生物合成 ——可结合进入BLM的末端胺基部分的非天然胺基化合物,.,四环类抗生素的定向生物合成,微生物发酵产生的一些四环素类抗生素,四环类抗生素的定向生物合成,在生产金霉素时需添加氯化物作为前体，而当生产四环素时，则必须要在发酵培养基中添加氯离子抑制剂，如溴化物或M-促进剂等，从而抑制金霉素的合成而得到四环素产物 另外，用金色链霉菌在发酵的金霉素过程中添加适量的甲基化反应抑制剂如磺胺嘧啶钠，能够获得去甲基金霉素。

非基因改变定向生物合成的研究进展,尽管近年来基因改变的定向生物合成发展很快，但利用非遗传操作定向生物合成原理寻找新的生理活性物质的研究还在不少实验室继续进行，特别是对一些肽类如环孢菌素A、aureobasidins及糖肽类如替考拉宁产生菌的定向生物合成研究取得了很大的进展,二、添加外源酶抑制剂的杂交生物合成 与微生物新药的发现,杂交生物合成（hybrid biosynthesis）似乎可以理解为是一种“强化”的非遗传定向生物合成，如在苦霉素产生菌发酵过程中添加聚乙酰途径中β-酮酯酰基合成酶抑制剂—线兰菌素(cerulenin)，使其失去合成苦霉素大环内酯苷元(picronolide)的能力而只能合成糖基同时在发酵过程中添加泰乐菌素大环内酯苷元(protylonolide)，使其与苦霉素生产菌产生的糖基结合，得到一种被称之为M4365G1的杂合抗生素(hybrid antibiotic)杂交生物合成与微生物新药的发现,杂交生物合成产物工业化的可能性,尽管通过杂交生物合成能够得到一些新的抗生素，但由于所添加的浅蓝菌素本身就是一种昂贵的抗生素，再则所添加的苷元的结构受到限制，所以这种方法似乎没有很大的实际意义。

三、非定向诱变的突变生物合成 与微生物新药的发现,突变生物合成（mutational biosynthesis）： 突变生物合成是指野生型产生菌经化学或物理等因素诱变处理后，丧失合成原来次级代谢产物的能力而成为阻断突变株，然后在发酵培养阻断突变株时添加某种外源物质，参与生物合成以获得新的次级代谢产物的过程 另外，突变生物合成也包括由于突变而引起产生新的次级代谢产物突变生物合成原理 ——阻断突变株的类型,营养缺陷型突变株： 由于编码菌体生长之必须的酶的基因发生了突变，而使菌体不能生长，导致不能合成次级代谢产物因此，这类突变株也可以称为初级代谢阻断突变株 独需型突变株： 这种突变株的生长和初级代谢正常，但由于编码次级代谢产物合成的某一基因发生突变，而使丧失了合成次级代谢产物的能力这是突变生物合成所需要的突变株 双重阻断突变株： 即突变既发生在编码初级代谢酶的基因上，也发生在编码次级代谢酶的基因上突变生物合成与微生物新药发现,.,利用独需型突变株合成产生新抗生素的基本原理,突变生物合成的基本流程,.,突变生物合成产生的新抗生素,.,红霉素生物 合成途径,.,突变株产生的 新蒽环类抗生素,.,,突变株产生的一些新的次级代谢产物,.,我国应用突变生物合成原理找到的小诺霉素,.,四、原生质体融合与微生物新药的发现,微生物原生质体融合，即是指将双新株的微生物细胞分别通过酶解脱壁，使之形成原生质体，然后在高渗溶液的条件下混合，并加入物理的（如电融合）或化学的(如聚乙二醇)或生物的（如仙台病毒）助融条件，使双亲株的原生质发生相互凝集，通过细胞质融合，核融合，尔后发生基因组间的交换，重组，进而可以在适宜的条件下再生出微生物细胞壁，获得重组子的过程。

利用微生物原生质融合寻找新抗生素的基本原理是来源于两种已知产生不同抗生素的产生菌的融合子，有可能将它们的部分生物合成基因整合在一起而产生新的杂合抗生素；另一个原理是由于抗生素产生菌中存在着沉默基因，当这些沉默基因受到外源物质刺激后，有可能被激活而产生结构与亲株完全不同的新的抗生素 应用这种方法获得的第一个新抗生素是吲哚佐霉素（indloizomycin）：其亲株为链霉素产生菌灰色霉菌和天神霉素（istamycin）产生菌天神链霉菌S. tenjimariensis第二节 生物合成途径的基因定向改变 与微生物新药的发现,组合生物合成 Combinatorial biosynthesis,是一种通过对天然产物生物合成途径中的基因进行中断、置换及重组等操作，改变原来抗生素产生菌或其他天然产物产生菌生物合成代谢产物的途径，产生具有新颖结构的“非天然的天然杂合产物（unnatural natural hybrid compounds）”的技术或方法组合生物合成的潜能 potential,重组、组合、互补、替换 R=可利用的基因 • n=基因的等位形式 化合物数＝Rn R=4, n=4 Compounds=44=256,组合生物合成的原理,生物合成酶基因的结构和组成 生物合成酶基因的特异性及底物宽容性 生物合成酶基因之间的相互作用 生物合成途径的研究基础,一、具有聚酮体生物合成途径的 微生物药物产生菌的组合生物合成,一些具有聚酮体生物合成（polyketide synthases，PKSs）途径的“天然产物”，如红霉素、阿维菌素、泰乐菌素、柔红霉素、阿克拉霉素、西罗莫司和利福霉素等可采用组合生物合成。

具PKS途径的抗生素,1、红霉素产生菌的组合生物合成,通过操作PKS的模块中单个基因的组合生物合成； 在非天然产物产生菌中过量表达组合生物合成产物； 通过操作PKS模块之间连接的组合生物合成 ； 通过操作脱氧糖途径基因的组合生物合成红霉素产生菌的组合生物合成的可能性,参与红霉素生物合成的PKSs，或6－脱氧红霉内酯合成酶（6-deoxyerythronolide B synthase，DEBS）有6个模块组成，每个模块负责合成聚酮体中的一部分 由于各模块之间的协调性，以及每个模块延伸单位的选择、功能和立体化学性质的催化结构域，因此，就有可能通过对PKSs结构域或模块的操作获得具有新颖结构的化合物 由于具有聚酮体结构的化合物其结构非常复杂和具有众多的立体异构体，因而，难以用常规的化学方法来获得红 霉 素 的 生 物 合 成 途 径,PKS中的每一个模块的组成,酮基合成酶（ketosynthase，KS） 酰基转移酶（acyl transferase，AT） 酰基载体蛋白（acyl carrier protein，ACP β-酮基修饰酶：包括酮基还原酶（ketoreductase，KR）、脱氢酶（dehydrogenase，DH）和烯酰还原酶（enoylreductase，ER） DEBS含有编码三个独立的多肽亚单位的6个模块 大多数典型的聚酮体合成途径的产物包括对PKS产物的修饰，如将脱氧糖或氨基糖进行糖苷化以及通过细胞色素P450进行氧化。

图中所示的LD为装载域（loading domains），TE为硫酯酶（esterases）1）通过操作PKS的模块中单个基因的组合生物合成,一是用利福霉素PKS模块2中的DH/ER/KR结构域取代红霉素PKS模块2中的KR； 二是将模块5中的KR缺失； 三是用利福霉素模块2中的丙二酰－特异性AT取代模块6中的甲基丙二酰－特异性的AT），将得到一个发生三重突变的PKS产物2）在非天然产物产生菌中过量 表达组合生物合成产物,将E.coli 开发成能够表达PKS产物需要解决的问题主要有三个方面： 一是能够功能性表达巨大的蛋白（330kDa）； 二是PKS亚单位的ACP结构域的翻译后磷酸泛酰巯基乙胺酰化； 三是聚酮体途径中的前体物质，特别是（2S）－甲基丙二酰－CoA在E.coli中不存在Pfeifer等的工作包括：,运用来源于枯草芽孢杆菌非核糖体多肽合成酶（NRPS）基因簇的磷酸泛酰巯基乙胺酰转移酶（phosphopantetheinyl transferase）基因sfp，以对PKS亚单位的ACP结构域的翻译后磷酸泛酰巯基乙胺酰化； 过量表达E.coli中的丙酰－CoA合成酶基因prpE，扰乱丙酰－CoA代谢途径，以及过量表达来自S.coelicolar的丙酰－CoA羧化酶基因pcc，使丙酰－CoA转化为（2S）－甲基丙二酰－CoA,3）通过操作PKS模块之间连接的组合生物合成,通过对DEBS模块在E.coli和体外的表达研究，发现在PKS装配过程中那些短的模块内和多肽内的“连接件”是至关重要的成分。

研究发现在相继非共价连接的模块中，其氨基和羧基末端存在有多肽内连接件，这种连接件与单个多肽内的模块之间的连接件不同 因此，使用一种合适的连接件就有可能允许杂合的模块之间进行功能性连接a：已经鉴定了不同的模块内和多肽内的连接件，并由此指导合成模块之间的聚酮体中间体，这里需要合适的氨基和羧基末端连接配对，以产生功能性连接模块； b：在构建功能性互补体时，可以使用编码来源于不同微生物多个模块的全亚基； 如图所示：来源于苦霉素（picromycin）的PKS（PikAI和PikAII），与来源于竹桃霉素（oleandomycin）的PKS（OleA3）相结合4）通过操作脱氧糖途径基因的组合生物合成,对已经发现的由自然界中植物、真菌和细菌产生的很多具有生理活性的糖苷类化合物的分析发现，连接在苷元上的糖基的结构大多为6-脱氧己糖（6-deoxyhexoses, 6DOHs） 据统计，这些具有生理活性的糖苷类化合物的结构上含有70多种不同的6-脱氧己糖由放线菌产生的具有不同生理活性 的糖苷化合物的结构特性,具有单糖残基的化合物：乌达霉素A、柔红霉素、urdamycin A和rebeccamycin； 具有双糖残基的化合物：光辉霉素（mithramycin）； 具有三糖残基的化合物：乌达霉素A（urdamycin A）和光辉霉素（前者同时具有单糖和三糖。