微生物学实验指导.doc

微生物学实验技术教学大纲课程编号： 课程中英文名称：微生物学实验技术 授课教师及职称： 李增波开课院系、教研室/研究室： 授课对象： 课程类别：选修课学时：20学分：2.0预修课程/相关知识要求：微生物学授课目的及内容简介： 微生物学实验课是与微生物学理论课同学期开设的一门重要的技术基础课通过本课程的教学，使学生较熟练的掌握微生物学实验的基本操作技术和初步掌握研究微生物的基本方法通过对具体微生物材料的观察、分析，进一步加深和巩固对微生物学理论课所学知识的理解并提高学生分析和解决实际问题的能力本课程的基本内容：1. 掌握显微镜的构造、使用技术及保养方法；2. 掌握干热灭菌箱、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱的使用；3. 掌握基本染色原理和方法以及制片技术；4. 掌握细菌、酵母菌、霉菌的基本形态结构、生理生化特征和血清学特性，具有菌种初步鉴定的基本技能；5. 掌握无菌操作方法，熟悉微生物分离、筛选和育种的基本知识和技能；6. 熟悉菌种保藏的一般方法教材及主要参考书目及文献：1. 杜连祥，路福平主编《微生物学实验技术》，中国轻工业出版社，2005，8.2. 杜连祥等主编《工业微生物实验技术》，天津市科学技术出版社，1992，10.主要内容与安排：实验一 学习显微镜的结构及使用实验二 培养基的制备与灭菌实验三 细菌的简单染色和革兰氏染色实验四 细菌的荚膜染色实验五 放线菌和真菌形态观察实验六 微生物细胞大小测定和微生物显微镜直接计数法实验七 土壤中微生物的稀释分离、纯化及无菌操作技术实验八 生素效价的生物测定微生物综合实验 柠檬酸发酵及提取实验一 学显微镜的结构及使用一、实验目的：人的眼睛只能识别大小为0.1㎜的物体。

显微镜是精密的放大仪器，是生物学研究不可缺少的工具我们用它可以观察肉眼看不见的微小生物的结构中学最 常用的是光学显微镜，为了正确操作、妥善保管和维护显微镜，使之延长使用年限，我们必须首先了解显微镜的结构和功能1、了解普通光学显微镜的基本构造，能够规范和较熟练地使用2、了解几种特殊光学显微镜的构造、工作原理和用途二 显微镜的结构： 一台显微镜包括机械装置和光学系统两大部分，注意比较和识别1.机械部分（1）镜筒 为显微镜上部圆形中空的长筒，筒口上端安装目镜，下端与物镜转换器相连作用是保护成像的光路与亮度2）转换器 固着在镜筒下端，分两层，上层固着不动，下层可自由转动转换器上有2～4个圆孔，用来安装不同倍数的低倍或高倍物镜3）粗准焦螺旋 位于镜臂的上方，可以转动，以使镜筒能上下移动，从而调节焦距4）细准焦螺旋 位于镜臂的下方，它的移动范围较粗准焦螺旋小，可以细调焦距5）镜座 是位于镜臂的下方，显微镜的底部，呈马蹄形的金属座用以稳固和支持镜身6）镜柱 从镜座向上直立的短柱上连镜臂，下连镜座，可以支持镜臂和载物台7)倾斜关节 镜柱和镜臂交界处有一个能活动的关节它可以使显微镜在一定的范围内后倾（一般倾斜不得超过45°）便于观察。

但是在使用临时封片观察时，禁止使用倾斜关节，尤其是装片内含酸性试剂时严禁使用，以免污损镜体8)载物台 从镜臂向前方伸出的金属平台呈方形或圆形，是放置玻片标本的地方其中央具有通光孔，在通光孔的左右有一个弹性的金属压片夹，用来压住载玻片较高级的显微镜，在载物台上常具有推进器，它包括夹片夹和推进螺旋，除夹住切片外，还可使切片在载物台上移动2.光学部分（1)目镜 它是安装在镜筒上端的镜头是由一组透镜组成的，它可以使物镜成倍地分辨、放大物像，例如 5×、10×、15×、20×2)物镜 是决定显微镜质量的关键部件安装在转换器的孔上，也是由一组透镜组成的，能够把物体清晰地放大一般有三个放大倍数不同的物镜，即：低倍物镜 （8×或10×）、高倍物镜（40×或45×）和油浸物镜（90×或100×），根据需要可选择一个使用显微镜的放大倍数是目镜倍数乘以物镜的倍数3)反光镜 在聚光器的下面有一个一面平另一面凹的双面圆镜可作各种方向的翻转，光线较强时使用平面镜，反之使用凹面镜4)聚光器 （学生用显微镜一般没有这个装置）是由凹透镜组成的，它可以集中反光镜投射来的光线在镜柱前面有一个聚光器调节螺旋，它可以使聚光器升降，用以调节光线的强弱，下降时明亮度降低，上升时明亮度加强。

5)虹彩光圈 又称可变光阑，由多数金属片组成（学生用显微镜一般没有这个装置），在较高级的显微镜上具有此装置使用时移动其把柄，可控制 聚光器 透镜的通光范围，用以调节光的强度虹彩光圈下常附有金属圈，其上装有滤光片，可调节光源的色调6)遮光器 简单的显微镜无聚光器和虹彩光圈，而装有遮光器遮光器呈圆盘状，上面有大小不等的圆孔（光圈）光圈对准通光孔，可以调节光线的强弱3.显微镜的成像原理（放大原理）光线→反光镜→遮光器→通光孔→标本（一定要透明）→物镜的透镜（第一次放大成倒立实像）→镜筒→目镜（再放大成虚像）→眼三、显微镜的使用方法（1）取镜安放取镜 右手握住镜臂，左手平托镜座，保持镜体直立特别要禁止单手提着显微镜走，防止目镜从镜筒中滑脱）安放 放置桌边时动作要轻一般应在身体的前面，略偏左，镜筒向前，镜臂向后，距桌边7～10 ㎝处，以便观察和防止掉落安放目镜和物镜2）对光转动转换器，使低倍物镜正对通光孔左眼注视目镜内，右眼同时睁开，用手转动反光镜，面向光源在目镜里看见一个圆形、明亮的视野（一定要用非直射光）把一个较大的光圈对准通光孔3）低倍镜的使用观察任何标本都必须先用低倍镜①放置切片 升高镜筒，把玻片标本放在载物台中央，标本材料正对通光孔的中心，用压片夹压住载玻片的两端。

②调焦 两眼从侧面注视物镜，转动粗准焦螺旋，让镜筒徐徐下降，至物镜距玻片2～5 ㎜处然后用左眼注视目镜，右眼同时睁开，（以便绘图），同时用手反方向（逆时针方向）转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓上升，直到看清物像为止如果不够清 楚，可用细准焦螺旋调节不可以在调焦时边观察边使镜筒下降，以免压碎装片和镜头③低倍镜的观察 由所用的目镜放大倍数与物镜放大倍数相乘，即为原物被放大的倍数如果物像不在视野中央，要慢慢移动到视野中央，适当再进行调节4）高倍镜的使用①选好目标 先用低倍物镜确定要观察的目标，将其移至视野中央转动转换器，把低倍物镜轻轻移开，原位置小心换上高倍物镜用高倍物镜工作距离较短，操作要十分仔细，以防镜头碰击玻片）②调焦 在正常情况下，当高倍物镜转正之后，在视野中央即可见到模糊的物像，只要向反时针方向略微调动细准焦螺旋，既可获得清晰的物像在换上高倍物镜观察时，视野变小变暗，要重新调节视野亮度，可升高聚光器或利用凹面反光镜5）油镜的使用（中学生一般不使用，在这里不做详述）（6）使用后的整理观察结束，应先将镜筒升高，聚光器下降，再取下切片，然后转动转换器，使物镜与通光孔错开，做好清洁工作清洁完毕，再下降镜筒，使两个物镜位于载物台上 通光孔的两侧，呈“八”字形，将反光镜转至与载物台垂直，罩上防尘罩，仍用右手握住镜臂，左手平托镜座，按号放回镜箱中。

四 讨论：1．降低镜筒时，操作者最关键的姿势应该是什么？其重要性是什么？2．当视野太明亮，光线刺眼时，这样的光线会使人眼的视网膜永久性损坏其原因和解决的方法是什么？实验二 培养基的制备与灭菌一、实验目的（1） 熟悉玻璃器皿的洗涤包装和灭菌前的准备工作2） 学习微生物培养基和无菌水的制备，了解培养基配方中各成分的作用、制备流程及各环节的操作技术与应用3） 学习并掌握培养基的高压蒸气灭菌原理、操作关键技术和灭菌技术二、实验原理培养基的制备原理：培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组分的营养物质调制而成的营养基质人工制备培养基的目的，在于给微生物创造一个良好的营养条件把一定的培养基放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的环境和场所自然界中，微生物种类繁多，由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究上的目的不同，所以培养基在组成原料上也各有差异但是，不同种类和不同组成的培养基中，均应含有满足微生物生长发育的水分、碳源、氮源、无机盐和生长素以及某些特需的微量元素等此外，培养基还应具有适宜的酸碱度(pH值)和一定缓冲能力及一定的氧化还原电位和合适的渗透压根据制备培养基对所选用的营养物质的来源，可将培养基分为天然培养基、半合成培养基和合成培养基三类。

按照培养基的形态可将培养基分为液体培养基和固体培养基根据培养基使用目的，可将培养基分为选择培养基、加富培养基及鉴别培养基等培养基的类型和种类是多种多样的，必须根据不同的微生物和不同的目的进行选择配制，本实验分别配制常用培养细菌、放线菌和真菌的牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号合成培养基和马铃薯蔗糖培养基等固体培养基固体培养基是在液体培养基中添加凝固剂制成的，常用的凝固剂有琼脂、明胶和硅酸钠，其中以琼脂最为常用，其主要成份为多糖类物质，性质较稳定，一般微生物不能分解，故用凝固剂而不致引起化学成份变化琼脂在95℃的热水中才开始融化，融化后的琼脂冷却到45℃才重新凝固因此用琼脂制成的固体培养基在一般微生物的培养温度范围内(25℃-37℃)不会融化而保持固体状态高压蒸气灭菌原理：高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的表Ⅴ-2 蛋白质含水量与凝固所需温度的关系 卵自蛋白含水量(%) 30分钟内凝固所需温度(℃) 50 25 18 6 0 56 74-80 80-90 145 160-170表Ⅴ-3 干热与湿热穿透力及灭菌效果比较温 度 (℃)时间(小时)透过布层的温度(℃)灭 菌20层40层100层干热 130-1404867270.5不完全湿热 105.3310l10l10l完 全在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低(表Ⅴ-2)，二是湿热的穿透力比干热大(表Ⅴ-3)；三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26kJ(千焦)的热量。

这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见表Ⅴ-4一般培养基用1.05kg/cm2，121.3℃ 15-30分钟可达到彻底灭菌的目的灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变例如含糖培养基用0.56kg/cm2(8磅/英寸2)，112.6℃灭菌15分。