免疫学：免疫学实验.ppt

免疫学实验免疫学实验 抗血清制备和抗体效价检测实验一：抗原制备、免疫（4学时）实验二：抽血、放血，分离抗血清（4学时）实验三：抗体效价检测（8学时）v（一）直接凝集试验（4学时）v（二）双向免疫扩散（4学时） 抗血清制备的原理 用具有抗原性的物质注入到健康动物的机用具有抗原性的物质注入到健康动物的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体抗体主要存在于血清中，经多分泌抗体抗体主要存在于血清中，经多次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集动物血液，再从血液中分离析出然后采集动物血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清血清，从而获得抗血清如何制备高效价的抗血清一、实验动物的免疫反应性一、实验动物的免疫反应性二、抗原的免疫原性二、抗原的免疫原性v 免疫原性强的抗原刺激高应答性的机体，常可获得高效价的免疫血免疫原性强的抗原刺激高应答性的机体，常可获得高效价的免疫血清而使用免疫原性弱的抗原免疫时，则需同时加用佐剂以增强抗原清而使用免疫原性弱的抗原免疫时，则需同时加用佐剂以增强抗原的免疫原性。

合成性抗原和基因工程抗原等半抗原物质需先通过人工的免疫原性合成性抗原和基因工程抗原等半抗原物质需先通过人工的方法与蛋白质载体连接后再与佐剂混合免疫动物，方可获得理想的的方法与蛋白质载体连接后再与佐剂混合免疫动物，方可获得理想的免疫效果免疫效果 三、抗原的剂量三、抗原的剂量 对于纯的可溶性抗原的免疫剂量，通常小鼠首次抗原剂量为对于纯的可溶性抗原的免疫剂量，通常小鼠首次抗原剂量为50～～100μg/次，大鼠为次，大鼠为100～～200μg/次，兔为次，兔为100μg ～～1 mg/次，合成免次，合成免疫原为疫原为2 mg(半抗原约为半抗原约为20～～200μg)，一般需要与等量的福氏完全佐，一般需要与等量的福氏完全佐剂混合加强免疫的剂量为首次计量的剂混合加强免疫的剂量为首次计量的1/2，通常用不完全福氏佐剂或，通常用不完全福氏佐剂或不用佐剂如需制备高度特异性的抗血清，可选用低剂量抗原短程免不用佐剂如需制备高度特异性的抗血清，可选用低剂量抗原短程免疫法；反之，欲获得高效价的抗血清，宜采用大剂量抗原长程免疫法疫法；反之，欲获得高效价的抗血清，宜采用大剂量抗原长程免疫法四、免疫途径四、免疫途径五、免疫时间间隔五、免疫时间间隔动物的选择v羊、马、鸡、猴、豚鼠、兔都是常用的免疫动物，羊、马、鸡、猴、豚鼠、兔都是常用的免疫动物，在实验中，选择动物时应考虑抗原与动物的种属在实验中，选择动物时应考虑抗原与动物的种属关系、抗原性质与动物种类、免疫血清的需要量、关系、抗原性质与动物种类、免疫血清的需要量、免疫血清的要求以及动物个体等因素。

免疫血清的要求以及动物个体等因素v免疫用动物应选适龄、健壮．最好为雄性免疫用动物应选适龄、健壮．最好为雄性v最常用的实验动物是家兔，一般选择选择年龄在最常用的实验动物是家兔，一般选择选择年龄在6个月以上当年繁殖的个月以上当年繁殖的♂性，体重性，体重2 ～～3公斤，健公斤，健康家兔三只，免疫前用金属编号牌固定兔耳，或康家兔三只，免疫前用金属编号牌固定兔耳，或用染料涂沫在动物的背部，作出明确的标记用染料涂沫在动物的背部，作出明确的标记抗原制备抗原制备一、可溶性抗原一、可溶性抗原 本实验采用牛血清白蛋白（用灭菌生理盐水本实验采用牛血清白蛋白（用灭菌生理盐水将抗原稀释为将抗原稀释为2mg/ml ））二、颗粒性抗原二、颗粒性抗原 本实验采用苏云金芽孢杆菌本实验采用苏云金芽孢杆菌DB4菌株的鞭毛菌株的鞭毛抗原（用生理盐水将制备的抗原母液稀释至麦氏比抗原（用生理盐水将制备的抗原母液稀释至麦氏比浊管第浊管第7管的浓度管的浓度麦氏比浊管1% BaCl1% BaCl2 2（（ml) ml) 1% H1% H2 2SOSO4 4(ml)(ml)麦麦1 10.1 9.90.1 9.9麦麦2 20.2 9.80.2 9.8麦麦3 30.30.3 9.7 9.7麦麦4 40.4 9.60.4 9.6麦麦5 50.5 9.50.5 9.5麦麦6 60.60.6 9.4 9.4麦麦7 70.70.7 9.3 9.3麦麦8 80.8 9.20.8 9.2麦麦9 90.90.9 9.1 9.1麦麦1010 1.01.0 9.0 9.0佐剂佐剂v福氏完全佐剂（福氏完全佐剂（Freund’s complete adjuvant））v福氏不完全佐剂（福氏不完全佐剂（Freund’s incomplete adjuvant））抗原乳剂的配制抗原乳剂的配制v方法一方法一:将等量的完全佐剂和抗原溶液分别吸入离心管内，将等量的完全佐剂和抗原溶液分别吸入离心管内，在振荡器上振荡至少在振荡器上振荡至少30分钟，形成油包水乳剂。

分钟，形成油包水乳剂v方法二将等量的完全佐剂和抗原溶液分别吸入两个方法二将等量的完全佐剂和抗原溶液分别吸入两个5ml注注射器内，在两个注射器的射器内，在两个注射器的12# 针头间套上一根长约针头间套上一根长约8～～12cm的医用无毒塑料管，将两个注射器连接在一起（塑的医用无毒塑料管，将两个注射器连接在一起（塑料管必须先经酒精浸泡消毒，使用时取出，用灭菌生理盐料管必须先经酒精浸泡消毒，使用时取出，用灭菌生理盐水冲洗后，与注射器针头相连接，塑料管与针头的口径须水冲洗后，与注射器针头相连接，塑料管与针头的口径须合适，不能松，稍紧些为宜），针头插进塑料管约合适，不能松，稍紧些为宜），针头插进塑料管约1～～2cm然后由两人相对而坐后缓缓推动针蕊，使管内溶液进然后由两人相对而坐后缓缓推动针蕊，使管内溶液进入塑料管道至对侧注射器内，每次推动针蕊时必须把管内入塑料管道至对侧注射器内，每次推动针蕊时必须把管内容物全部推出，另一侧也同样操作，使管内液体往返混合，容物全部推出，另一侧也同样操作，使管内液体往返混合，直至形成油包水乳剂为止直至形成油包水乳剂为止v方法三：将等量的佐剂和抗原溶液倒入钵内，经过反复碾方法三：将等量的佐剂和抗原溶液倒入钵内，经过反复碾磨，也可形成油包水乳剂。

磨，也可形成油包水乳剂鞭毛鞭毛(H)抗原制备方法：抗原制备方法： 将苏云金芽胞杆菌从斜面移接到平板的软琼脂培养基的中将苏云金芽胞杆菌从斜面移接到平板的软琼脂培养基的中央，央，30℃℃培养培养1夜夜(9-12h)取最外边菌体再接种于另一软取最外边菌体再接种于另一软琼脂平板的中央如上法移接琼脂平板的中央如上法移接4-6次，最后一次取最外边次，最后一次取最外边菌体接种子摇瓶菌体接种子摇瓶(500mL三角瓶，装摇瓶培养基三角瓶，装摇瓶培养基50mL)中，中，28—30℃℃振荡培养振荡培养10-14h培养液离心培养液离心(3000 r/min，，15min)，去上清液，再悬浮于，去上清液，再悬浮于50mL含含0.25％的％的福尔马林生理盐水中，再离心福尔马林生理盐水中，再离心15min，去上清液，将收集，去上清液，将收集的菌体悬浮在的菌体悬浮在10mL含含0.25％福尔马林生理盐水中，制成％福尔马林生理盐水中，制成抗原母液，置冰箱保存备用抗原母液，置冰箱保存备用注意：注意：若发现自发凝集则弃去不用，保存抗若发现自发凝集则弃去不用，保存抗原液使用期为原液使用期为4周说明：说明：由于苏云金芽胞杆菌为周生鞭毛菌，由于苏云金芽胞杆菌为周生鞭毛菌，鞭毛多且长，将菌体紧密地包裹着，用此鞭毛多且长，将菌体紧密地包裹着，用此法制备的抗原即代表法制备的抗原即代表H抗原。

免疫动物后抗原免疫动物后即产生相应的鞭毛抗体即产生相应的鞭毛抗体免疫时间和上课班级免疫时间和上课班级v第一次免疫第一次免疫 9月月24日日 06生科生科12v第二次免疫第二次免疫 9月月28日日 06（应用）生技（应用）生技v第三次免疫第三次免疫 10月月7日日 06生工生工12v第四次免疫第四次免疫 10月月14日日 06生工生工34v第五次免疫第五次免疫 10月月25日日 楚天学院楚天学院06生工生工123免疫的时间、剂量和途径（牛血清白蛋白）日期日期剂量剂量mlml途径途径备注备注9 9月月2 24 4日日9 9月月2 28 8日日1 10 0月月7 7日日1 10 0月月1 14 4日日1 10 0月月2 25 5日日2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.0两脚掌共两脚掌共0.8 ml0.8 ml，肌肉两处共，肌肉两处共0.6 ml0.6 ml，皮下两处共，皮下两处共 0.6 ml0.6 ml两脚掌共两脚掌共0.8 ml0.8 ml，肌肉两处共，肌肉两处共 0.6 ml0.6 ml，皮下两处共，皮下两处共 0.6 ml0.6 ml耳静脉耳静脉 0.8 ml0.8 ml，肌肉两处共，肌肉两处共 0.6 ml0.6 ml，皮下两处共，皮下两处共0.6 ml0.6 ml耳静脉耳静脉 1.2 ml1.2 ml，皮下，皮下 0.8 ml0.8 ml耳静脉耳静脉 1.5 ml1.5 ml，皮下，皮下 1.0 ml1.0 ml1 1：：1 1混合完全混合完全弗氏佐剂弗氏佐剂1 1：：1 1混合不完混合不完全弗氏佐剂全弗氏佐剂不混合佐剂不混合佐剂不混合佐剂不混合佐剂不混合佐剂不混合佐剂鞭毛抗原免疫方案鞭毛抗原免疫方案v时时 间间 剂剂量量　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　途途径径v9月月24日日 0.5ml　　　　　　 耳耳静静脉脉v9月月28日日 1.0mL　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　耳耳静静脉脉v10月月7日日 1.5mL　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　耳耳静静脉脉v10月月14日日 2.0ml　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　耳耳静静脉脉v10月月25日日 2.5mL　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 耳耳静静脉脉家兔的抓取方法小白鼠的控制采血（抽血、放血），分离抗血清采血（抽血、放血），分离抗血清一、采血一、采血（一）心脏抽血（一）心脏抽血v家兔固定（仰卧）---准确找到心脏部位---剪毛（心脏部位）---消毒---进针（50ml注射器接带硅胶管的12号针头）抽血，抽至50ml，从硅胶管接头处取下注射器，拔针头，将血液注入100ml无菌空三角瓶，再重复上述操作继续抽血，直至抽完。

v（二）颈动脉放血（二）颈动脉放血v家兔固定（仰卧，身体及头部固定）---剪毛（颈部）---找颈动脉管（消毒---剖开颈部；开皮、膜、肌肉，找到气管两边的颈动脉管（桃红色，有脉动））---小心分开动脉上的肌肉、神经（2条，白色）等---开口（见图）---放血，接入100ml无菌空三角瓶v注意：看到气管，停用所有锐器，可用止血钳、钝玻棒注意不要剪破毛细动脉管动脉开口示意图身头A A系索线系索线正上方正上方B止血钳止血钳正上方正上方c止血钳止血钳D剪断剪断E开口处开口处下前方下前方占血管直径占血管直径1/3v（三）耳静脉抽血（三）耳静脉抽血v家兔固定（仰卧）---找到静脉---刮毛---充血（酒精或二甲苯）---血管开口（或注射器抽血）---放血---无菌三角瓶接血 二、抗血清的分离，结果观察二、抗血清的分离，结果观察1、斜置装血液的三角瓶0.5-1h；2、用玻棒剥落、松动瓶壁上的血块；3、原样包扎好，做好记号，放进冰箱（4℃）；4、结果观察（估计各组分离的血清量并观察描述血清颜色）；5、各组将血样瓶清洁处理v去血块，离心取上清（去血块，离心取上清（3000rpm,20min3000rpm,20min）），，加叠氮钠（终浓度为加叠氮钠（终浓度为0.1%0.1%），混匀），混匀，，分装小瓶，低温保存。

分装小瓶，低温保存v思考题思考题: :如何获得高效价的抗血清如何获得高效价的抗血清? ?直接凝集试验直接凝集试验v直接凝集试验原理直接凝集试验原理：：在电解质存在的情况下，在电解质存在的情况下，颗颗粒性抗原（如细菌菌体或鞭毛、红细胞等）与相应粒性抗原（如细菌菌体或鞭毛、红细胞等）与相应抗体混合一定时间后，发生特异性结合而生成抗原抗体混合一定时间后，发生特异性结合而生成抗原抗体复合物，便可出现肉眼可见的凝集块直接凝抗体复合物，便可出现肉眼可见的凝集块直接凝集试验又分试管法和玻片法集试验又分试管法和玻片法v直接凝集试验用途：直接凝集试验用途：v试管法不仅用于未知抗原（如细菌）或抗体的鉴定，试管法不仅用于未知抗原（如细菌）或抗体的鉴定，还可测定抗体的效价还可测定抗体的效价v玻片法可用于细菌的快速鉴定和血型鉴定等，是一玻片法可用于细菌的快速鉴定和血型鉴定等，是一种定性试验种定性试验直接凝集试验（直接凝集试验（ⅠⅠ、试管法）、试管法） 一、实验目的一、实验目的 1、掌握试管凝集试验方法掌握试管凝集试验方法 2、观察试管中抗原与其相应抗体结合所出现的凝、观察试管中抗原与其相应抗体结合所出现的凝集现象，了解抗原抗体反应的特异性。

集现象，了解抗原抗体反应的特异性 3、掌握试管凝集试验中抗体效价的判定方法掌握试管凝集试验中抗体效价的判定方法二、实验材料：二、实验材料：B.t.H-Ag及其相应的抗体及其相应的抗体三、实验方法和步骤：三、实验方法和步骤：1 1、、AgAg稀释稀释（用生理盐水稀释至相当于（用生理盐水稀释至相当于McFarlandMcFarland比浊管第比浊管第6 6支的浓度，约支的浓度，约1010亿亿/ml/ml）：）：4 4人一组，人一组，0.1-0.1-0.6mlAg0.6mlAg到到6ml6ml生理盐水中生理盐水中2 2、、AbAb稀释稀释（见图）：（见图）：4 4人一组作人一组作1 1套抗体稀释套抗体稀释3 3、加、加AgAg到到AbAb稀释管4 4、、37℃37℃水浴水浴2-42-4小时5 5、结果观察及判定、结果观察及判定AbAb的效价麦氏比浊管1% BaCl1% BaCl2 2（（ml) ml) 1% H1% H2 2SOSO4 4(ml)(ml)麦麦1 10.1 9.90.1 9.9麦麦2 20.2 9.80.2 9.8麦麦3 30.30.3 9.7 9.7麦麦4 40.4 9.60.4 9.6麦麦5 50.5 9.50.5 9.5麦麦6 60.60.6 9.4 9.4麦麦7 70.70.7 9.3 9.3麦麦8 80.8 9.20.8 9.2麦麦9 90.90.9 9.1 9.1麦麦1010 1.01.0 9.0 9.0抗体的稀释示意图抗体的稀释示意图生理盐水生理盐水H H抗原抗原四、注意事项：四、注意事项：1 1、每一稀释度需换一个枪头；、每一稀释度需换一个枪头；2 2、对照管不可加入抗体。

对照管不可加入抗体3 3、抗原、抗体不可在凝集管外相混；抗原（抗体）、抗原、抗体不可在凝集管外相混；抗原（抗体）不可混入生理盐水瓶不可混入生理盐水瓶4 4、半小时后可以看初步的结果半小时后可以看初步的结果试管法凝集试验结果判断试管法凝集试验结果判断  以出现以出现50%50%凝集（凝集（++++）的抗体最高稀释）的抗体最高稀释倍数，为抗体的效价倍数，为抗体的效价凝集反应程度的判断标准：凝集反应程度的判断标准：++++++++ 100%100%凝集（完全凝集，上层变清）凝集（完全凝集，上层变清）+++ +++ 75%75%凝集（绝大部分凝集，上层略浑）凝集（绝大部分凝集，上层略浑）++ 50%++ 50%凝集（部分凝集，上层较浑）凝集（部分凝集，上层较浑）+ + 25% 25%凝集（很少部分凝集，上层浑浊）凝集（很少部分凝集，上层浑浊）- - 无凝集（液体浑浊，与阴性对照管相同）无凝集（液体浑浊，与阴性对照管相同）双向免疫扩散双向免疫扩散实验原理：实验原理：将可溶性抗原和相应抗体分别加到琼将可溶性抗原和相应抗体分别加到琼脂糖凝胶板相对应的孔中，两者各自向四周脂糖凝胶板相对应的孔中，两者各自向四周扩散，若二者相对应，在比例合适处会形成扩散，若二者相对应，在比例合适处会形成白色沉淀线。

若同时含有多种抗原抗体系统，白色沉淀线若同时含有多种抗原抗体系统，则在琼脂层中形成多条沉淀线同时，还会则在琼脂层中形成多条沉淀线同时，还会因抗原抗体的相对浓度、分子质量的差异而因抗原抗体的相对浓度、分子质量的差异而使沉淀线的部位、形状出现差异，从而对抗使沉淀线的部位、形状出现差异，从而对抗原进行定性、半定量及组分分析，对抗体进原进行定性、半定量及组分分析，对抗体进行定性及效价测定等行定性及效价测定等本次实验目的本次实验目的1、分析待测抗原的组分数量；、分析待测抗原的组分数量；2、测定各组分相应抗血清的效价测定各组分相应抗血清的效价 以出现沉淀线抗体的最高稀释倍数为该抗以出现沉淀线抗体的最高稀释倍数为该抗体效价双扩实验步骤双扩实验步骤1 1、融化凝胶、倒胶制备凝胶板（每人、融化凝胶、倒胶制备凝胶板（每人1 1板）2 2、、AgAg、、AbAb稀释（见图、稀释（见图、4 4人人1 1套套）3 3、打孔、点样（加、打孔、点样（加AgAg、、AbAb，每孔，每孔8ul8ul）4 4、、37℃37℃保温保湿扩散保温保湿扩散1d1d，结果观察结果观察ckAg高浓度高浓度Ab高浓度高浓度01记号：学号记号：学号Ab低浓度低浓度Ag低浓度低浓度Ag稀释示意图稀释示意图 2X 4X 8X 16X 32X 0.10ml0.10ml0.10ml生生理理盐盐水水AgAg：：牛血清原液或牛血清白蛋白牛血清原液或牛血清白蛋白 Ag 学号 01 02 03 04Ab稀释示意图稀释示意图0.10ml0.10ml0.10ml生生理理盐盐水水抗抗体体 2X 4X 8X 16X 32X CK（（无抗体）无抗体）兔抗牛血清抗体或兔抗牛血清白蛋白抗体兔抗牛血清抗体或兔抗牛血清白蛋白抗体v将双扩实验结果用铅笔绘图并分析判断：将双扩实验结果用铅笔绘图并分析判断：（（1 1）待测）待测AgAg中至少有几种组分？中至少有几种组分？（（2 2）待测）待测AgAg各组分相对应的各组分相对应的AbAb的效价？的效价？如：待测抗原组分一相对应的抗体的效价为如：待测抗原组分一相对应的抗体的效价为1 1：：X X。

v注意沉淀线的数量、部位、走向、粗细、注意沉淀线的数量、部位、走向、粗细、清晰度等清晰度等★★结果分析结果分析思考题v1、本实验采用的是什么、本实验采用的是什么Ag、、Ab？？v2、、 Ag、、Ab为什么要设置一系列的为什么要设置一系列的浓度浓度 (方阵排列方阵排列) ？？ “效价效价”是指是指Ag的、的、还是还是Ab的？与的？与Ag、、Ab的浓度有何关的浓度有何关系？系？。