生物技术综合实验课：实验十六 细胞色素C提取及分析.ppt

实验十六细胞色素C提取及分析一目的1了解和掌握利用盐析、有机酸沉淀、吸附 层析、离子交换层析等技术提取、分离、 纯化细胞色素C的原理和操作方法2.了解和掌握细胞色素C含量和其性质的分析二原理 细胞色素C是细胞线粒体呼吸链中的一员，起传递电子的作用，也是唯一容易从线粒体中分离出来的细胞色素，它是一种红色的稳定的可溶性蛋白，分子量为12000-13000d，等电点pH为10.7含铁量为0.38-0.43%，每分子只含一个铁原子对热、对酸、碱都较稳定，可抵抗0.3mol/L盐酸和0.1mol/L氢氧化钾溶液的长时间处理细胞色素C氧化型水溶液呈深红色，还原型水溶液呈桃红色氧化型二个最大吸收峰为408nm、530nm;还原型为415nm、520nm、550nm还原型细胞色素C较其氧化型稳定 细胞色素C溶于水，易溶于酸性溶液，故可在酸性溶液中提取细胞色素C在pH7.0时带正电荷，可被人造沸石吸附，但它的亲和力远小于25%（NH4）2SO4中的NH4离子,它在饱和的硫酸铵溶液中不产生沉淀，但可用20%三氯醋酸把它从硫酸铵溶液中沉淀出来它还可被724弱酸性阳离子交换树脂吸附，它的亲和力远小于洗脱液中的钠离子与树脂的亲和力。

故可用吸附层析、盐析、有机酸沉淀、离子交换层析等方法进行分离，纯化细胞色素C在医疗上的应用 提纯的细胞色素C制成注射液可作为细胞呼吸激活剂，适用于因组织缺氧引起的一系列疾患如脑血管障碍、脑软化、脑出血、中风后遗症、脑动脉硬化症、脑外伤、婴儿百日咳脑病、不可逆休克缺氧、脑栓塞、脑振汤后遗症、心代偿不全、心肌炎、狭心症、白喉心肌炎、肺心病、心绞痛、心肌梗塞、肺炎、肺癌、硅肺、喘息、肺病气肿以及支气管扩张引起的呼吸困难、一氧化碳中毒、安眠药中毒、麻醉前处理、新生儿假死、神经麻痹症等上世纪八十年代生物系校办工厂曾生产过细胞色素C注射液,并作为典型产品来带动教学也因为在提取分离、纯化它的过程中涉及了许多生化技术，而一直保留下来三试剂与器材 (一)试剂 1.2MH2SO4溶液100ml 2.1MNH4OH溶液200ml 3.0.2%NaCL溶液1000mL 4.25%（NH4）2SO4溶液200mL 5.20%三氯醋酸溶液100mL 6.0.06MNa2HPO40.4MNaCL洗脱液100mL 7.氰化钾溶液：（不配） 8去细胞色素C的心肌悬浮液：（不配）（二）器材 1.高速捣碎机、剪刀、纱布 2.玻璃烧杯及玻棒 3.27mm19CM玻璃层析柱 4.透析袋 5.低速离心机 6.724弱酸性阳离子交换树脂。

附：AmberLiteIRO-50或724弱酸性阳离子交换树脂再生处理： 用过的离子交换树脂先用2N的氨水洗至白色，无离子水洗至中性，再用2倍体积树脂量2MHCL在50-60水浴中搅拌20分钟，去酸液树脂用无离子水洗至中性然后用2M氨水浸泡2时以上，由氢型转为氨型再用无离子水洗至中性，备用四操作方法 （一）样品（猪心）预处理： 每组称大约500克新鲜猪心，先用自来水把猪心里的血块冲洗干净，剪去脂肪、纫带后，用剪刀剪成细块 （二）细胞色素C的提取： 1剪成细块的猪心称重后量出2倍量无离子水，把细块猪心放入组织捣碎机捣碎筒里，加入适当上述量出的无离子水，开机高速把猪心捣碎糜烂,倒进大烧杯，把余下的无离子水全部加进去，用2M H2SO4调pH至4.0,室温搅拌1.5-2小时 2提取物用1MNH4OH调pH6.o,三层纱布包好压滤,滤液用1N氨水调至pH7.53000r/min，离心5分钟，取滤液并量出其体积按每100mL滤液加3克人造沸石的比例加入人造沸石搅拌吸附1小时.静置，待人造沸石沉淀后，倒去上清液 3红色的人造沸石先用无离子水洗三次，后用0.2%NaCL溶液洗涤三次.再用无离子水洗涤至上清液澄清为止。

4用无离子水把红色的人造沸石装柱用25% （NH4）2SO4洗脱至沸石白色为止（控制流速每分钟2ml左右）或把红色人造沸石装在烧杯里，用少量多次的25%（NH4）2SO4洗脱至沸石白色为止 5量出洗脱液（红色）体积，加固体硫酸铵 （NH4）2SO4 （25克/100mL），搅拌至产生沉淀，静置30-60分钟离心（3000转/分）5分钟，沉淀弃去离心液仍有悬浮物用滤纸过滤，取红色上清液 6 量出红色上清液体积，在搅拌下慢慢加入20%三氯醋酸（2.5mL/100mL上清液）产生沉淀，立刻离心(3000r/min)10分钟,收集沉淀物 7沉淀物溶解于少量无离子水，装入透析袋，对无离子水透析过夜，换水三至五次透析至透析液中无SO42-存在此仍为细胞色素C的粗品三）细胞色素的纯化、精制 1把再生处理好的AmberLite IRO-50或 724型弱酸性阳离子交换树脂 (铵型)用无离子水装进（27mm19CM玻璃）层析柱，阳离子交换树脂约高9厘米即可先用无离子水流过柱一遍至柱中水平面与树脂面齐平即关闭柱的出水口 2把细胞色素C粗品溶液加入到离子交换树脂层析柱上方，控制流速，让树脂（白色）尽可能吸附细胞色素C而慢慢转变为深红色。

待细胞色素C粗品溶液全部过完层析柱 3将红色树脂用无离子水冲出，红色与白色树脂分开，分别装于小烧杯红色树脂用无离子水搅拌洗涤至水溶液澄清为止白色树脂回收待再生处理 4把红色树脂用无离子水重新装柱待无离子水流至与树脂面齐平时，用0.06M Na2HPO40.4MNaCL洗脱液进行洗脱,控制流速 (大约1mL/分钟),收集深红色流出液少于10mL内 5深红色流出液装于透析袋中，在4下对无离子水进行透析，换水三至五次，至无CL-存在，如有沉淀，离心去沉淀（这步可不做） 6细胞色素C精品装瓶密闭于冰箱保存，以备其含量及其性质的测定四）细胞色素C的分析 1细胞色素C的含量测定（1）标准曲线的制定 取1支（15mg/支）细胞色素C针剂加无离子水定溶至25mL,并加入少许连二亚硫酸钠（保险粉），摇匀取5支试管编号，按下表加入各种溶液，混匀，以无离子水为空白，在520nm下测定光密度然后以标准细胞色素C的浓度为横座标，O.D520nm值为纵座标作曲线试管号3标准品(ml)0.51234无离子水(ml)3.53210CytC含量(mg)0.30.61.21.82.4O.D520nm值（2）样品含量测定取1ml待测样品，用无离子水定溶至25ml，再从其中取1ml稀释液加3ml无离子水和少许保险粉，摇匀，在520nm测光密度。

从标准曲线中找出对应的细胞色素C的含量，然后计算出待测样品的细胞色素C的总含量2细胞色素C的吸收光谱测绘 根据样品含量测定结果，把样品稀释成200g/ml的浓度，测定其400600nm的光密度，以光密度为横座标，波长（nm）为横座标画出细胞色素C的吸收光谱，（以铁氰化钾使细胞色素C氧化成氧化型，以连二亚硫酸钠（保险粉）使细胞色素C还原成还原型） 注：测定波长400-500nm时样品浓度还要再稀释，否则光密度在2以上无法读数二试剂与器材 1. 试剂1)LB 液体培养基 ： 蛋白胨（tryptone）10g、酵母粉（yeast extract）5g、NaCl 10g, 加800ml双蒸水溶解，用10M NaOH调节PH至7.2-7.5，定容至1000ml 分装，高压灭菌，4保存 2) 氨苄青霉素溶液： 无菌双蒸水配成100mg/ml，分装，-20保存，使用终浓度为 50ug/ml,或100ug/ml 3) IPTG溶液： 将238.3 mg IPTG 溶解于10ml双蒸水，0.22m细菌滤器过滤除 菌，-20保存备用,贮存浓度为100 mM 4) 20%葡萄糖溶液： 20g葡萄糖溶解于适量双蒸水，定容至100ml，121,15min 灭菌，4保存。

2. 器材含pBSK质粒工程菌及含重组pGH-J374质粒工程菌 超净工作台、 恒温摇床、离心机三 操作方法 1. 挑取含pBSK质粒工程菌及含重组pGH-J374质粒工程菌单菌落，分别接种于含氨苄青霉（终浓度为50ug/ml，以下同)的5ml的LB培养基中，于37、250rpm过夜培养12-14h至对数生长期 2. 取三支已灭菌的大试管，分别加入5ml含有氨苄青霉素的LB培养液，编号为1#，2#，3#，另取一个250ml的三角瓶，编号为4，加入50ml含氨苄青霉素的LB培养液 3. 1#试管 接50ul空载工程菌（含pBSK）过夜培养物， 2528培养1012h ； 2#试管 接50ul重组菌（含pGH-J374）过夜培养 物，2528培养1012h ； 3#试管 接50ul重组菌（含pGH-J374）过夜培养物，37培养至O.D600约为0.5（约34h)， 然后加入20%葡萄糖50ul使终浓度为0.2%，及 100mM IPTG 5ul使浓度为0.1mM，2528 培养810h或过夜； 4#三角瓶 接500ul重组菌（含pGH-J374）过夜 培养物，37培养至O.D600约为0.5（约3 4h)然后只加入100mM IPTG 50ul使终浓度为 0.1 mM，2528培养810h或过夜。

4. 收集菌体（所用离心管不需灭菌）分别将13培养 物全部收集到三个7ml离心指管中，弃上清，编上相应 编号；三角瓶培养的50ml菌液混匀后吸取5ml于7ml离心 管（编号为4#）中离心，上清收集到另一个指管，编号 为5#,其余的培养液用 50ml离心管5,000rpm,4，离心 10min，弃上清，菌体用裂解缓冲液重悬后用超声波破 碎细胞或保存于20备用 5. 于紫外灯下观察1-5#指管收集的菌体或上清夜，观察哪 支管有荧光，记录观察到的现象注意事项与提示11.本实验的目的是比较该重组DNA在大肠杆菌中表达时是否受IPTG和葡萄糖存在的影响， 1#、2#管的细菌在25-28培养时不加IPTG和葡萄糖3#管除加IPTG外还加入葡萄糖，糖的浓度要大于0.2%以上4 4#三角瓶细菌仅加IPTG 也仅指这次实验所用的重组DNA菌体而言有的重组DNA菌体在其表达时除需加IPTG外仍需加入少量的葡萄糖作诱导在转管培养及收菌时要注意各管编号要相应对好，不能混乱2.不同的重组DNA在不同的宿主菌中蛋白的表达量往往受到IPTG浓度和温度的影响，最好采用不同温度或不同浓度的IPTG来诱导，看哪种温度或哪种浓度条件下其蛋白表达量最大。

在科研中一般都要求这样做3.由于本实验所表达的是一种荧光蛋白基因，其在大肠杆菌中表达的蛋白有很强的荧光离心后收集的菌体在紫外线的照射下都可见黄绿色荧光，所以把1#、2#、3#、4#沉淀菌体放在紫外灯下观察其是否有荧光及其荧光的强弱，就可判断其是否有表达及其所表达的强度实验十二金属螯合亲和层析分离蛋白质 一目的 1学习亲和层析的原理 2掌握亲和层析法分离蛋白质的技术与 操作二.原理以普通凝胶作载载体，连连接上金属离子制成螯合吸附剂剂，用于分离纯纯化蛋白质质，这样这样 的方法称为为金属螯合亲亲和层层析蛋白质对质对 金属离子具有亲亲和力是这这种方法的理论论依据已知蛋白质质中的组组氨酸和半胱氨酸残基在接近中性的水溶液中能与镍镍或铜铜离子形成比较稳较稳 定的络络合物，因此，连连接上镍镍或铜铜离子的载载体凝胶可以选择选择 性地吸附含咪唑唑基和巯巯基的肽肽和蛋白质质过过渡金属元素镍镍在较较低pH范围时围时 （pH6-8），有利于选择选择 性地吸附带带咪唑唑基和巯巯基的肽肽和蛋白质质 在碱性pH时，使吸附更有效，但选择性降低金属螯合亲和层析行为在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白质分子表面咪唑基和巯基的稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。

用IPTG诱导表达的蛋白质含有特定的组氨酸标记物，这种可溶性蛋白质能用金属亲和层析法进行分离，且操作简单，快速，纯化效率高三.试剂与器材(一)试剂.1.0.05mol/LEDTA0.5mol/LNaCL溶液50mL2.2mol/LNaCL溶液50mL31mol/LNaOH溶液50mL40。