PCR实验室7500SOP.docx

分 子 生 物 操 作 手 册文件标题：ABI 7500 型核酸扩增荧光检测仪使 用、维护、校准程序文件编号：LAB-SOP-FZSW-011版 本 号：B发布日期：生效日期：修 订 号：0编 写 人：审核人：发布部门：中心主任：批 准 人：其 他：页码：第 1 页 ， 共 4 页【】ABI 7500 型核酸扩增荧光检测仪使用、维护、校准程序-LAB-SOP-FZSW-0111. 目的：确保 ABI7500 仪器的正确使用及正常运行2. 适用范围：美国应用生物系统公司生产的 ABI7500 实时荧光定量 PCR 仪3. 运行环境：电源：推荐配备合适的 UPS 或稳压器通风：仪器的通风应该没有阻挡温度：推荐实验室配备空调，温度应该控制在 10～30℃之间湿度：20-80%；对于潮湿的省份，推荐实验室配备除湿机空间：易于操作，安全4.操作程序：开关机程序：开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量 PCR 仪主机，等主机面板上的绿灯 亮后即可打开 ABI7500 系统软件，进行实验关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭 ABI7500 系统软件，然后关掉定量 PCR 仪主 机的电源，最后关闭电脑。

创建绝对定量反应板文件：依次选择 Start > Programs > Applied Biosystems 7500 >Applied Biosystems 7500 SDSSoftware ()，以启动 SDS 软件;或在桌面双击Applied Biosystems 7500 SDS Software()图标选择 File （文件） > New （新建）在 New Document Wizard （新建文件向导）窗口中，从 Assay （实验）下拉列表中选择 Absolute Quantification (Standard Curve)（绝对定量，标准曲线）接受 Container （反应板类型）和 Template （模板）字段中的默认设置（即分别为 96-Well Clear（空白 96 孔板）和 Blank Document （空白反应板））在 Default Plate Name （默认反应板名）字段中输入反应板文件名，或接受默认文件名 单击 Next > （下一步 >）选择要添加到反应板文件的探针A） 单击以选择一个探针按住 Ctrl 键单击可选择多个探针 如果在 Detector Manager （探针管理器）列表中未列出探针，请创建探针。

B） 单击 Add >> （添加 >>）探针即被添加到反应板文件C） 单击 Next > （下一步 >）为每个反应孔指定探针和任务A） 单击一个反应孔（或对于重复选择一组反应孔）以选取它（们）B） 单击探针名，为反应孔选定探针C） 单击 Task （任务）栏的下边，以指定探针任务D） 为包含标准样本的反应孔输入量值E） 单击 Use （使用）所选反应孔中显示探针任务和颜色F） 单击 Finish （完成）SDS 软件即创建反应板文件分 子 生 物 操 作 手 册文件标题：ABI 7500 型核酸扩增荧光检测仪使 用、维护、校准程序文件编号：LAB-SOP-FZSW-011版 本 号：B发布日期：生效日期：修 订 号：0编 写 人：审核人：发布部门：中心主任：批 准 人：其 他：页码：第 2 页 ， 共 4 页输入样本名A） 单击 或选择 View （视图） > Well Inspector （反应孔设定）B） 单击一个反应孔或拖动鼠标选取多个重复反应孔C） 输入样本名D） 如果必要，更改 Passive Reference （阳性参比荧光）设置默认情况下，选择ROX荧光。

E）重复步骤 b 至 d，直到您为反应板上的所有反应孔均指定好样本名和阳性参比荧光在 Setup （设定）选项卡上，检查并核对每个反应孔的信息设置热循环条件并开始运行反应板选择 Instrument（仪器）选项卡默认情况下，显示两步法反转录- 聚合酶链反应 (RT-PCR) 方法中 PCR 步骤的标准 PCR条件验证以下各项：A） 如果您使用两步法 RT-PCR – 则已设置默认的 PCR 热循环条件B） 如果您使用“中山大学达安基因股份有限公司”的试剂 – 请按以下循环条件设置：93℃ 2分钟→1个循环；93℃ 45秒→55℃ 60秒→40个循环C） Sample Volume （样本体积）为 50 LD） 9600 Emulation 选项选取选择 File （文件） > Save As （另存为），为绝对定量反应板文件输入一个文件名，然 后单击 Save （保存）将反应板装入仪器中单击 Start （开始）在仪器运行 PCR 程序期间， Instrument （仪器）选项卡上会显示实时状态信息，并报告 荧光信号强度程序运行结束后，状态值和按钮变为灰色，而且 Analysis （分析）按钮 ( ) 变为可用状态，并显示信息提示您程序是否成功运行。

程序运行期间生成的所有数据都保存到步骤 中指定的绝对定量反应板文件中设置分析参数选择 Amplification Plot （扩增图谱）选项卡，然后从 Data （数据）下拉列表中选择Delta Rn vs Cycle （∆ Rn 随循环变化）选择要在图谱上显示的反应孔如果不作选择，图谱将显示为空白从 Detector （探针）下拉列表中，选择一个探针SDS 软件显示所选探针和反应孔的图谱 为探针设置基线1） 在 Analysis Settings （分析设置）下边，选择 Manual Baseline （手动设置基 线）1） 在 Start (cycle) （开始循环）和 End(cycle) （结束循环）字段中输入相应的值， 确保扩增曲线的增长从 End Cycle（结束循环）值之后的循环处开始为探针设置阈值1） 在 Analysis Settings （分析设置）下边，选择 Manual Ct （手动 Ct）2） 用鼠标拖动阈值设置条，直到阈值位于：背景的上边•分 子 生 物 操 作 手 册文件标题：ABI 7500 型核酸扩增荧光检测仪使 用、维护、校准程序文件编号：LAB-SOP-FZSW-011版 本 号：B发布日期：生效日期：修 订 号：0编 写 人：审核人：发布部门：中心主任：批 准 人：其 他：页码：第 3 页 ， 共 4 页•扩增曲线的平台期和线性增长期的下边•扩增曲线的指数增长期之内SDS 软件调整阈值，并于分析之后在Threshold （阈值）字段中显示此值。

重复步骤 至. 4，为实验分析中的所有剩余探针设置适当的基线和阈值单击 Analysis （分析） > Analyze （执行分析），以使用调整后的基线和阈值设置重新 分析数据分析并查看绝对定量数据Plate （反应板）选项卡：显示每个反应孔的结果数据，包括：••每个反应孔的样本名、探针任务和颜色计算值 - 量值（默认值）、∆ Rn 或 Ct选择Analysis （分析） > Display （显示）以选择要显示的值Spectra （光谱）选项卡：显示所选反应孔的荧光光谱••用鼠标指针点击并拖动 Cycle （循环）滑块上的指示器，可查看每一循环的光谱 Cycle # （循环次数）文本框中显示滑块指示器的当前位置Component （成分）选项卡：显示整个 PCR 运行期间所选反应孔的每种荧光的完整光谱表 现每次只能显示第一个选取的反应孔Amplification Plot （扩增图谱）选项卡：在三个 Amplification Plot （扩增图谱）上， 您可查看特定样本的扩增后荧光信号读取情况••Amplification Plot （扩增图谱）上显示所选反应孔中的所有样本Rn vs. Cycle (Linear) （Rn 随循环变化，线性）视图：显示校正后报告荧光强度(Rn) 荧光随循环变化的曲线。

您可通过此图来识别和检查不规则扩增• ∆ Rn (Log) （∆ Rn 随循环变化，对数）视图：显示荧光 (∆ Rn) 随循环数变化的 曲线您可通过此图来识别和检查不规则扩增•Ct vs. Well Position （Ct 值与反应孔位置关系）视图：显示阈值循环 (CT) 与反应孔位置的关系变化图您可通过此图查找探针数据设置中不当设置的极端值Standard Curve （标准曲线）：显示指定为标准的样本标准曲线SDS 软件根据此标准曲 线推断并计算出未知样本的量Report （报告）：以表格方式显示所选反应孔的数据报告中的数据栏取决于正运行的实验分析类型对于绝对定量实验分析，可能包括以下数据栏：Well （反应孔）、Sample Name（样本名）、Detector （探针）、Task （任务）、Ct、StdDev Ct （Ct 值标准偏差）、Qty（数量）、Mean Qty（平均数量）和StdDev Qty （标准偏差数量）Qty （数量）栏中的值根据样本的标准曲线推断并计算得出在 Report Settings （报告设置）对话框中可 设置报告显示格式和打印方式5.仪器维护保养每星期维护任务归档或备份 SDS 反应板文件•使用不脱毛的布块擦拭仪器表面 •每月维护任务：执行背景校正•执行计算机硬盘碎片整理程序 •分 子 生 物 操 作 手 册文件标题：ABI 7500 型核酸扩增荧光检测仪使 用、维护、校准程序文件编号：LAB-SOP-FZSW-011版 本 号：B发布日期：生效日期：修 订 号：0编 写 人：审核人：发布部门：中心主任：批 准 人：其 他：页码：第 4 页 ， 共 4 页•••••半年维护任务：执行纯荧光校正执行目标区 (ROI) 校正其它维护任务：需要时执行以下维护任务，以解决遇到的问题： 去除样本块中的污染物更换卤素灯更换仪器保险丝。