分子标记与个体鉴别.ppt

第九章第九章 分子标记和个体鉴别分子标记和个体鉴别分子标记的种类在药学和法医学上的应用分子标记的概念分子标记的概念n n分子标记分子标记( (molecular markers)molecular markers) 是指可遗传的并可检测的是指可遗传的并可检测的DNADNA序列序列 ，是能够用，是能够用来来区分个体区分个体特点的特点的DNA片段n n作用在于鉴别个体作用在于鉴别个体: : 个体间存在的自然个体间存在的自然遗传变异遗传变异，进而造成许多，进而造成许多遗传序列的遗传序列的多态性多态性，即这些，即这些序列在不同的个体表序列在不同的个体表现不同现不同分子标记就是通过查找和应用这种遗传分子标记就是通过查找和应用这种遗传差异基础上的变异对个体、性状和基因进行差异基础上的变异对个体、性状和基因进行鉴别鉴别鉴别个体鉴别个体 的意义的意义n n法医学：根据现场遗留的蛛丝马迹发现罪犯法医学：根据现场遗留的蛛丝马迹发现罪犯n n遗传学：发现个体之间的相互关系；亲子鉴别遗传学：发现个体之间的相互关系；亲子鉴别n n分类学：鉴别微生物，动植物。

分类学：鉴别微生物，动植物研究系统进化研究系统进化n n医药学：发现病原（鉴定病原性微生物）和研究医药学：发现病原（鉴定病原性微生物）和研究病员的变异病员的变异中药鉴定中药鉴定（明确药用动植物，制剂（明确药用动植物，制剂鉴定）分子标记的特点分子标记的特点n n1. 直接以DNA形式表现，与生长发育无关，取材不受限（从本质上解决）n n2.标记的种类和数量多，遍及整个基因组有选择余地）n n3.同一标记的多态性高有个体鉴别意义）分子标记的特点分子标记的特点n n4. 4. 中性：中性：某些标记某些标记不影响目标性状的表达，与不不影响目标性状的表达，与不良良性状性状无必然连锁（没有干扰问题无必然连锁（没有干扰问题） 在真核生物中，基因组在真核生物中，基因组DNADNA多态性要远远多于各种基因的遗传多态性，多态性要远远多于各种基因的遗传多态性，因为基因组中存在着大量的不编码的因为基因组中存在着大量的不编码的DNADNA序列，它们的变异不受或较序列，它们的变异不受或较少地受自然选择的制约少地受自然选择的制约n n n n5. 5. 许多分子标记表现为许多分子标记表现为共显性共显性（（codominancecodominance，两，两个都对表型有贡献个都对表型有贡献, ,谁也不占优势）谁也不占优势）, , 能够鉴别出能够鉴别出纯合基因型与杂合基因型纯合基因型与杂合基因型。

额外的优势）额外的优势）分子标记的种类分子标记的种类n n按照实验技术分类：第一类：分子杂交为核心 代表：RFLP第二类：PCR为核心 代表：RAPD、SSR、AFLP第三类：DNA序列为核心 代表：SNP ITS第一节、基于杂交技术的分子标记技术第一节、基于杂交技术的分子标记技术n n限制性片段长度多态性 RFLPn n可变串联重复多态性 VNTRSouthern blotting1.RFLPn n限限制制性性片片段段长长度度多多态态性性( (restriction restriction fragment fragment length polymorphismlength polymorphism，，缩写缩写RFLP) RFLP) 技术技术n n原理：原理：限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切特定特定DNADNA片段的大小片段的大小RFLPRFLP的产生的产生（酶切位点变异的突变如点突变（酶切位点变异的突变如点突变插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）RFLP原理图示：RFLP工作流程RFLP的探针1.1.叶绿体、线粒体（基因组序列短不需要探针杂叶绿体、线粒体（基因组序列短不需要探针杂交步骤即可检出多态性交步骤即可检出多态性）。

2.2.对于较大的基因组，酶切片段过多会产生重叠对于较大的基因组，酶切片段过多会产生重叠序列需要选择一个或数个遗传位点，用相应序列需要选择一个或数个遗传位点，用相应的探针产生的探针产生RFLPRFLP探针通常有两种来源：探针通常有两种来源：cDNAcDNA和和PstPstI I基因组克隆基因组克隆n ncDNAcDNA探针：表达基因作探针利用探针：表达基因作探针利用cDNAcDNA文库n nPstPstI I基因组克隆：单拷贝基因（非重复序列基因组克隆：单拷贝基因（非重复序列））相连接区域均为高度甲基化的序列相连接区域均为高度甲基化的序列RFLP的应用n n鉴定不同品种间的亲缘关系n n确定杂交或体细胞杂交品种是否成立n n基因定位n n以遗传作图为基础的基因克隆n n数量遗传研究数量性状位点QTLs作图n nQTLs（（quantitative trait loci））位点位点是指是指一个基因或一组连锁的基因上该位点变化后能一个基因或一组连锁的基因上该位点变化后能够使特定够使特定数量性状数量性状数量性状数量性状发生变异发生变异n n数量性状：人身高、动物体重、生育期、果实数量性状：人身高、动物体重、生育期、果实大小，产量高低等。

数量性状的变异呈连续性大小，产量高低等数量性状的变异呈连续性, ,杂交后代难以明确分组杂交后代难以明确分组, ,只能用度量单位进行只能用度量单位进行测量，并采用统计学方法分析测量，并采用统计学方法分析n n决定数量性状的基因决定数量性状的基因决定数量性状的基因决定数量性状的基因数目很多，数目很多，数目很多，数目很多，各基因的各基因的各基因的各基因的效应效应效应效应相等相等相等相等；各基因的；各基因的；各基因的；各基因的作用是累加作用是累加作用是累加作用是累加性的举例n n番茄的 Brix9-2-5、fw2.2 和 Ovate 分别作用于糖含量、果重和果形n n作图：基因差异比较 性状样本-----AFLP获得多态性位点------统计或区间作图法找到与数量性形状相关的多态性位点问题关键：如何用合适的探针找到相应的位点缺点：缺点：n nRFLPRFLP分分析析对对样样品品纯纯度度要要求求较较高高，，样样品品用用量量大大，，且且RFLPRFLP多多态态信信息息含含量量低低，，多多态态性性水水平平过过分分依依赖赖于于限限制制性性内内切切酶酶的的种种类类和和数数量量，，加加之之RFLPRFLP分分析析技技术术步步骤骤繁繁琐琐、、工工作作量量大大、、成成本本较较高高，，所所以以其其应应用用受受到到了了一一定定的的限限制制。

确确定定一一个个数数量量性性状状基基因因大大约约需需要要几几年年甚甚至至1010年时间n nTanksleyTanksley 实实验验室室从从2020世世纪纪8080年年代代末末开开始始研研究究番番茄茄果果实实重重量量的的数数量量遗遗传传，，19961996年年把把 fw2.2 fw2.2 定定位位到到第第2 2染染色色体体的的约约 150 150 kb kb 的的区区域域，，在在20002000年年完完成成了了克克隆隆工工作作，，前前后后花花了了1010多多年年的的时时间间；；以以色色列列的的 ZamirZamir 研研究究小小组组在在19951995年年把把1 1个个控控制制番番茄茄糖糖度度的的 QTL QTL Brix9-2-5 Brix9-2-5 定定位位在在第第9 9染染色色体体上上大大约约 9 9 cMcM 区区域域，，20002000年年最最终终将将其其鉴鉴定定为为 Lin5 Lin5 基基因因( (细细胞胞质质外外蔗蔗糖糖转转化化酶酶) )，，也也经经历历了了6 6年的时间年的时间2、、VNTRn n可变串联重复（可变串联重复（VaribleVarible number of tandem repeats number of tandem repeats，，缩写缩写VNTRVNTR））包括两种：包括两种： (1) (1) 小卫星小卫星( (minisatelliteminisatellite) )序列序列：重复单位：重复单位( (motif)motif)约有碱约有碱基基1010－－6060个（也有个（也有1616－－100100个碱基一说），在基因组中多个碱基一说），在基因组中多次出现。

几百次重复次出现几百次重复 (2) (2) 微卫星微卫星( (microsatellitemicrosatellite) )或简单重复序列或简单重复序列( (simple simple sequence repeatssequence repeats，，缩写缩写SSR)SSR)：：重复单位含有重复单位含有1-101-10个碱基 n n 上千次重复上千次重复VNTR在法医学上的应用在法医学上的应用n n小卫星小卫星DNADNA：： 人类人类DNADNA有有90%90%是非编码区，包括小卫星是非编码区，包括小卫星DNADNA，，有特定的重复序列有特定的重复序列这些卫星这些卫星DNADNA都是可遗传都是可遗传的，的，用与之序列匹配的探针杂交即可探测用与之序列匹配的探针杂交即可探测n n多位点探针和单位点探针多位点探针和单位点探针 起初建立能够与人类起初建立能够与人类DNADNA中许多小卫星中许多小卫星DNADNA序序列互补的探针称为多位点探针（列互补的探针称为多位点探针（Multi-Locus Multi-Locus Probe, MLP), Probe, MLP), 得到的检测结果称为得到的检测结果称为DNADNA指纹。

但指纹但由于条带多，不宜建立数据库以及进行分析后由于条带多，不宜建立数据库以及进行分析后来建立了单位点探针来建立了单位点探针SLPSLP，，只能看见两条带只能看见两条带二、基于二、基于PCR技术的分子标记技术的分子标记n n1 1、随机扩增、随机扩增n n随机扩增多态性随机扩增多态性 RAPDRAPDn n扩增片段长度多态性扩增片段长度多态性 AFLPAFLPn n2 2、、以特定序列位点为目的扩增以特定序列位点为目的扩增n n简单重复序列：微卫星简单重复序列：微卫星；；n n简单序列重复区间简单序列重复区间 ；；n n序列标记位点序列标记位点 ；；n n单链构型多态性等单链构型多态性等1.RAPDn n原理：原理：RAPDRAPD技术的全称是技术的全称是随机扩增随机扩增多态性多态性DNA(Random Amplified DNA(Random Amplified PolymorphicPolymorphic DNA) DNA)，，使用使用一系列具有一系列具有1010个左右碱基的单链随机引物，对基个左右碱基的单链随机引物，对基因组的因组的DNADNA全部进行全部进行PCRPCR扩增，以检测多态性。

扩增，以检测多态性n n由于整个基因组存在众多由于整个基因组存在众多反向重复序列反向重复序列，因此须，因此须对每一随机引物单独进行对每一随机引物单独进行PCRPCR单一引物与反向重单一引物与反向重复序列结合复序列结合使重复序列之间的区域得以扩增使重复序列之间的区域得以扩增引物结合位点引物结合位点DNADNA序列的改变以及两序列的改变以及两扩增位点之扩增位点之间间DNADNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异段数目和长度的差异原理示意图：原理示意图：若位点若位点2 2处碱基发生改变，则处碱基发生改变，则 RAPD的应用n n鉴定品种（家系分析、纯合系鉴定、变种同源分析）n n变异监测（污染，外来物种入侵----基因渐渗）n n标记辅助选择n n遗传作图分子标记物的辅助选择分子标记物的辅助选择n n借助分子标记（引物）达到对目标性状基因型选择借助分子标记（引物）达到对目标性状基因型选择的方法称为分子标记辅助选择的方法称为分子标记辅助选择 ( (molecular-assisted molecular-assisted selectionselection，，MAS) MAS) 。

n n n n过程：过程：利用标记物筛选出与目的性状连锁的多态性利用标记物筛选出与目的性状连锁的多态性序列，然后通过序列比较将序列转化为反映该性状序列，然后通过序列比较将序列转化为反映该性状的通用标记（的通用标记（PCRPCR引物）利用通用标记达到如下引物）利用通用标记达到如下目的：快速检测，提高育种的速度和精度目的：快速检测，提高育种的速度和精度分子标记物的辅助选择事例：分子标记物的辅助选择事例：完美标记完美标记n n如果分子标记物是目的性状基因本身，则称为“完美标记”n n澳大利亚向亚洲出口的面条专用面粉特殊的膨化性能：要求直链淀粉含量高饱和淀粉合成酶（GBSS）基因 利用完美标记PCR引物确定GBSS是否在小麦的4A染色体上，以达到检测的目的RAPD优点优点n n(1)(1)不需不需DNADNA探针，设计引物也不需要知道序列信息；探针，设计引物也不需要知道序列信息；n n(2)(2)用一个引物就可扩增出许多片段（一般一个引物用一个引物就可扩增出许多片段（一般一个引物可扩增可扩增6 6－－1212条片段，但对某些材料可能不能产生扩条片段，但对某些材料可能不能产生扩增产物）增产物） n n(3)(3)技术简单，技术简单，RAPDRAPD分析不涉及分析不涉及SouthernSouthern杂交、放射杂交、放射自显影或其它技术；自显影或其它技术；n n(4)(4)不象不象RFLPRFLP分析，分析，RAPDRAPD分析分析只需少量只需少量DNADNA样品样品；；(5)(5)成本较低，因为随机引物可买到，其价格不高；成本较低，因为随机引物可买到，其价格不高；RAPD的缺点：的缺点：n nRADPRADP图谱中某些弱带图谱中某些弱带重复性重复性较差，较差，n n目目前前该该法法在在引引物物长长度度和和序序列列及及应应用用的的引引物物数数目目、、扩扩增增反反应应条条件件等等实实验验技技术术方方面面未未标标准准化化，，影影响响了了不同条件下结果的可比性；不同条件下结果的可比性；n n每个每个标记含有的信息量小标记含有的信息量小；；n n很很容容易易有有假假阳阳性性或或假假阴阴性性结结果果，，在在胶胶上上看看见见的的一一条条带带也也有有可可能能包包含含了了不不同同的的扩扩增增产产物物，，因因为为所所用用的的凝凝胶胶电电泳泳类类型型只只能能分分开开不不同同大大小小的的片片段段，，而而不不能分开有不同碱基序列但有相同大小的片段；能分开有不同碱基序列但有相同大小的片段；2.AFLP n n原理：原理：原理：原理：AFLPAFLP的全称是的全称是扩增片段长度多态性扩增片段长度多态性（（Amplified Fragment Length PolymorphismAmplified Fragment Length Polymorphism））三个步骤：三个步骤：n n基组基组DNA DNA 经限制性内切酶酶切后经限制性内切酶酶切后, ,产生分子量大小不产生分子量大小不同的限制性片段。

同的限制性片段n n使用特定的双链接头与酶切使用特定的双链接头与酶切DNA DNA 片段连接作为扩增反片段连接作为扩增反应的模板应的模板, ,n n用含有选择性用含有选择性碱基碱基的引物对摸板的引物对摸板DNA DNA 进行扩增进行扩增, ,n n只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增基相匹配的限制性片段才可被扩增AFLP的实验原理的实验原理AFLP技术路线：荧光标记全自动AFLP原理与方法For ABI 377 DNA Sequencer and AFLP KitsAFLPAFLP的优缺点：的优缺点：n n优点：AFLP之优点为所需DNA量小，且利用严苛的PCR条件故再现性相当高n n缺点：n n此技术受到专利保护，应用受到限制，试剂盒价格昂贵n n另外，操作中通常要利用同位素标记，对样品DNA质量要求严格特定序列位点法特定序列位点法n n特定序列位点(sequence-tagged site，缩写STS)是对由其特定引物序列所界定的一类标记的统称利用特异PCR技术的最大优点是它产生的信息非常可靠，而不象RAPD、AFLP和利用随机探针产生的RFLP存在某种模糊性（如难以鉴别片段的来源）。

n n有很多种，最主要的是：微卫星法3.微卫星序列n nSTMS(Sequence-tagged microsatellites)：通常又称为简单重复序列SSRs（simple sequence repeats） ， 或 短 重 复 序 列STRs（short tandem repeats）n n微卫星DNA是一种广泛分布于真核生物基因组中的串状简单重复序列，每个重复单元的长度在1—10bp之间，与小卫星序列比较，它的重复序列很小，因此将其称为微小卫星序列原理n n常常 见见 的的 微微 卫卫 星星 如如 TGTG……TG= TGTG……TG= (TG)n(TG)n或或AATAAT……AAT= AATAAT……AAT= (AAT)n(AAT)n等等，，不不同同数数目目的的核核心心序序列呈串联重复排列，而呈现出列呈串联重复排列，而呈现出长度多态性长度多态性两个特点：两个特点：n n1 1、、在在基基因因组组中中，，因因每每个个SSRSSR序序列列的的基基本本单单元元重重复复次次数数在在不不同同个个体体间间差差异异很很大大，，从从而而形形成成其其位位置置的的多多态性n n2 2、、 而而 且且 每每 个个 SSRSSR座座 位位 两两 侧侧 侧侧 翼翼 序序 列列 ( (Flanking Flanking Region)Region)一一般般是是相相对对保保守守的的单单拷拷贝贝序序列列，，据据此此可可设设计引物。

计引物技术路线：：n n建立DNA文库，n n筛选鉴定微卫星DNA克隆（根据微卫星序列筛选克隆），然后测定这些克隆的侧翼序列，设计特异性引物来扩增SSR序列或者根据已有资料直接扩增n n后经聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色，通过比较谱带的相对迁移距离，便可知不同个体在某个SSR座位上的多态性 微卫星的优点：n n（1）微卫星DNA数量多且均匀分布在基因组中据估计，在基因组中平均30—50kb就存在一个微卫星，为在整个基因组中定位更多的基因提供了极大的方便n n（2）微卫星检测容易、重复性较好、省时，适合于进行自动化分析一个位点的检测一般可在24h内完成，且可同时进行多位点的检测在法医学上的应用在法医学上的应用n n需要精确的电泳方法数据库n n建立数据库有利于嫌疑犯的追踪n n单位点不足以进行个体识别，因此一般需要进行多位点检测，英国DNA数据库采用6个位点复合扩增，国际刑警组织要求4位点：THO1、VWA、FGA、D21S11，北美要求13个位点三、基于序列分析的分子标记方法1、单核苷酸多态性、单核苷酸多态性n n（（single nucleotide polymorphismsingle nucleotide polymorphism，，缩写缩写SNPSNP））n n是是指指在在基基因因组组内内特特定定核核苷苷酸酸位位置置上上存存在在两两种种不不同同碱碱基基，，其中最少一种在群体中的频率不小于其中最少一种在群体中的频率不小于1 1％。

％ n n同同一一位位点点的的不不同同等等位位基基因因之之间间常常常常只只有有一一个个或或几几个个核核苷苷酸酸的的差差异异，，因因此此在在分分子子水水平平上上对对单单个个核核苷苷酸酸的的差差异异进进行行检检测测是是很很有有意意义义的的目目前前SNPSNP作作为为一一种种新新的的分分子子标标记记，，已已有有20002000多多个个标标记记定定位位于于人人类类染染色色体体上上，，在在植植物物上上也也在在进进行行开开发发研研究究检检测测SNPSNP的的最最佳佳方方法法是是新新近近发展起来的发展起来的DNADNA芯片技术芯片技术SNP原理应用范围应用范围n nSNPSNP与与RFLPRFLP和和STRSTR等等DNADNA标记的主要不同在于：标记的主要不同在于：n n不再以不再以““长度长度””的差异作为检测手段而是直接以的差异作为检测手段而是直接以序列的差异作为标记序列的差异作为标记n n应用：应用：n n1 1、遗传图谱第三代标记遗传图谱第三代标记n n2 2、基因多样性和识别，定位疾病相关基因基因多样性和识别，定位疾病相关基因2、、ITS序列序列（（内转录间隔区）：内转录间隔区）：n n1818S-28S S-28S 核核糖体核核糖体DNADNA的内转录间隔区的内转录间隔区（（internal transcribed spacer)internal transcribed spacer)被被5.8S 5.8S 分为两分为两部分，其转录物不加入成熟核糖体，只是部分地部分，其转录物不加入成熟核糖体，只是部分地对其的成熟起作用可能是分子系统学研究中应用对其的成熟起作用可能是分子系统学研究中应用最为广泛的基因之一。

最为广泛的基因之一ITS序列序列n nITS区既具有核苷酸序列的高度变异性又有长度上的保守性，说明这些间隔区的序列很容易在近缘类群间排序，而且丰富的变异可在较低的分类阶元上（如属间、种间）解决植物系统发育问题3、线粒体DNA标记n n原理原理：n n线粒体基因组具有的独特优点：n n1、线粒体DNA分子小、拷贝数高; n n2、结构和组织简单而高度保守;n n3、母系遗传，缺乏重组; n n4、DNA突变率高.检查的位置检查的位置n n线粒体DNA在不同个体间有很大差别法医学上共同检测的区域是位于D环上的高可变区HV1和HV2线粒体线粒体DNA的特征与法医学意义的特征与法医学意义n nA A：稳定的母系遗传：母系血缘亲属具有完全相：稳定的母系遗传：母系血缘亲属具有完全相同的同的mtDNAmtDNA适合特殊适合特殊 类型的亲权鉴定（母类型的亲权鉴定（母- -子；子；同胞兄妹；母系血缘）同胞兄妹；母系血缘）n nB B：：拷贝数多拷贝数多：有利于微量检材；检测敏感度高有利于微量检材；检测敏感度高n nC C：片段短：抗降解，有利于降解检材，如角化组：片段短：抗降解，有利于降解检材，如角化组织（毛发等）。

织（毛发等）n nD D：突变率高：多态性高，个人识别能力强突变率高：多态性高，个人识别能力强n nE E：属于序列多态性，检测方法：属于序列多态性，检测方法RFLPRFLP；；ASPCRASPCR；；PCR-ASOPCR-ASO；测序等n nF F：单倍体型具有民族特征单倍体型具有民族特征n nG G：单倍体型具有种属特征单倍体型具有种属特征优缺点优缺点n n缺点：同一个体不同器官或同一器官出现序列不同的mtDNA Y染色体分析染色体分析n n使用使用Y-Y-STRsSTRs来鉴别性犯罪来鉴别性犯罪n n优点：优点：n nA A：父系伴性遗传：父系血缘男性具有完全相同：父系伴性遗传：父系血缘男性具有完全相同的的Y Y染色体染色体DNADNA遗传标记适合特殊类型的亲权遗传标记适合特殊类型的亲权鉴定（父鉴定（父- -子；同胞兄弟；父系血缘）子；同胞兄弟；父系血缘）n nB B：男性仅有，适于含有男性成分的混合斑检验男性仅有，适于含有男性成分的混合斑检验n nC C：单倍体型具有民族特征单倍体型具有民族特征n nD D：同时进行性别鉴定同时进行性别鉴定。