植物细胞骨架光学显微镜观察.docx

植物细胞骨架的光学显微镜观察黄斌 谢卓文 徐安乐 钟建良 邹天生（中山大学生命科学学院00 级生物科学专业，广州510275）【摘要】本实验根据细胞骨架的特性，利用适当浓度的Trit on X-100处理洋葱鳞茎内表皮 细胞，破坏细胞内大多数蛋白质而保存细胞骨架系统，再经考马斯蓝染色，在光学显微镜下 观察细胞骨架，对细胞骨架的分布，膜骨架，核骨架，胞间连丝等进行了初步的研究关键词】细胞骨架,光学显微镜,纤维,网络结构1 引言细胞骨架是真核生物细胞中的重要结构，起细胞支架的作用，并参与胞内物质运输、细胞运 动、分泌吸收、细胞通讯、有丝分裂等由于与细胞各项功能的密切关系，细胞骨架的研究 已成为当今细胞生物学中较具吸引力的领域之一对细胞骨架的研究须先对其进行观察本 实验以洋葱鳞茎内表皮细胞为材料对细胞骨架进行观察研究，基本原理是细胞内脂质和大部 分蛋白质可与去垢剂Trito n-100形成去垢剂-蛋白/脂质复合物，从而溶于水中被提取，而结 合成纤维状的细胞骨架蛋白则保持其在生活细胞中存在的状态之后用考马斯亮蓝对蛋白质 染色，使骨架系统在光学显微镜下可见，从而对其进行观察研究2 材料与方法2.1 材料新鲜洋葱鳞茎，撕取内表皮，切成约0.5cmx0.5cm大小。

2.2 器材光学显微镜、精确天平、0.02ml移液枪、50ml烧杯、玻璃滴管、容量瓶、试剂瓶、载玻片、 盖玻片、镊子2.3 试剂：• M-缓冲液：50mmol/L 咪唑、50mmol/LKCI、0.5mmol/LMgCI2、0.1mmol/LEDTA、 1mmol/LEGTA［乙二醇双（a氨基乙基）醚四乙酸］、1mmol/L巯基乙醇• 6mmol/LPH6.8 磷酸缓冲液：0.2149g Na2HPO4・12H2O、0.0816g KH2PO4 加入 100ml 蒸馏水• 1%TritonX-100： 0.5ml 100%TritonX-100 加入 A 液 49.5ml• 0.2%考马斯亮蓝R250： 0.2g考马斯亮蓝R250粉加入甲醇46.5ml、冰醋酸7ml、 蒸馏水 46.5ml• 3%戊二醛：6ml 25%戊二醛加入B液44ml2.4 方法将材料置于装有PH6.8磷酸缓冲液的烧杯中，使其下沉吸去磷酸缓冲液，用1 %Trit on X-100处理30分钟吸去Trit on X-100,用M-缓冲液洗三次，每次10分钟0.2%考马斯亮蓝R250染色30分钟用蒸馏水洗1-2次，展平置于载玻片上，加盖玻片，于普通光学显微镜下观 察。

选取骨架形态清晰、典型的细胞或细胞群，在适当放大倍数下摄像3 结果与分析3.1 细胞骨架观察结果光学显微镜下洋葱内表皮细胞的轮廓清晰可见（如图1）,细胞壁及其分界明显o 10x10倍 镜下可粗略观察到细胞内粗细不等的蓝色纤维、团块形成的网状结构同一细胞内各处骨架 的密集度不均匀,细胞核区域的纤维相对密集,蓝色浓重,甚至分辨不出网络结构,另外可 见细胞壁区域有零星蓝色纤维分布；相邻细胞的密集程度基本一致,但有少数细胞有较大不 同10x40倍镜下可清楚观察到蓝色的网状结构确实由线性纤维交织成，纤维间的结合点 稍膨大细胞边缘骨架较稀疏,但可见由与胞壁相同走向的纤维形成的细胞质膜的轮廓,与 细胞内部的纤维通过纵向的纤维相连相邻细胞有纤维穿过胞间的细胞壁调节显微镜焦距 可观察到细胞不同横切面的网络结构的变化，表明细胞骨架以三维立体结构的形式分布在整 个细胞内3.2 细胞骨架的分布制片可观察到较清晰的骨架结构，但是不同切片的细胞骨架在密集度、分布上有差异，可能 是处于不同生理状态或处理时间不同所致对于同一切片，边缘部分的细胞骨架较稀疏，说 明 Triton-100 对细胞骨架蛋白有破坏作用，也反映了细胞骨架蛋白间的结合是可逆的。

3.3 核骨架多数切片上的细胞可见蓝色较浓重的核区（图1a），但在用Trit on处理较久的切片上没有核区轮廓，表明核骨架在形态分布上与细胞质骨架并无明显（至少在光镜下）差异，但由于胞核有核纤层支撑的核膜，较难被去垢剂破坏，使去垢剂难以进入核中起作用，故需处理较 长时间才能得到与胞质同样的效果图1洋葱鳞茎内表皮细胞骨架显微镜照片a： 10x10倍光镜下洋葱鳞茎内表皮细胞骨架（箭头示细胞核区域重染色区） b： 10x40倍光镜下洋葱鳞茎内表皮细胞骨架（上方箭头示膜骨架，下方箭头示胞间连丝处骨架纤维）c： 10x100倍光镜下病变细胞骨架与正常细胞的对比（注意两箭头处染色对比）3.4 膜骨架对于去垢剂的提取作用，细胞质膜首当其冲，膜脂，膜蛋白必然很快溶解，但在显微镜下可见到紧贴细胞壁的包绕细胞质的一层结构（图1b），表明细胞除胞壁维持形态外，还有膜 骨架（或膜内侧细胞骨架）起作用而且膜骨架并非孤立起作用，可观察到它与胞质内部骨 架系统通过与壁垂直的纤维相连3.5 胞间连丝植物相邻细胞通过胞间连丝相通，交换物质切片上可见细胞相邻胞壁有纤维穿过（图1b）， 由此也验证了胞间连丝并非单纯的细胞壁上的穿孔，而是有细胞骨架参与构成的［1］。

另外， 切片边缘的细胞蓝色网络较稀释的现象可由胞间连丝解释：由于洋葱内表皮细胞单层排列 与鳞茎内部的茎肉细胞联系较少，少或没有胞间连丝；去垢剂要直接通过胞壁毕竟较难，但 可以很快通过胞间连丝进入细胞，故边缘的细胞其胞间连丝直接暴露于外部溶液中，去垢剂 进入起作用并流向内侧细胞，造成较快和较强的反应3.6 病变细胞的骨架细胞骨架对细胞的生存有重要作用，故细胞骨架可在一定程度上反映细胞的生理状态制片中可见个别细胞纤维网络与附近细胞相比非常稀疏（图1c），由于细胞骨架必须形成一定 密度的网络系统才能维持细胞的正常功能，可推测这些细胞发生病变或已经死亡这些细胞 有一个特征，即胞质边缘的蓝色较浓重，但不呈纤维状，可以猜测由于病变，骨架纤维断裂， 断裂片段转移到其他细胞进行再利用4 小结细胞骨架在细胞中呈由蛋白纤丝交织成的立体网状结构，并且处于动态变化中细胞骨架在 胞质、细胞核、质膜、胞壁中都有分布，参与细胞形态维持、物质运输、信号转导等作用 处于不同生理状态的细胞其细胞骨架有变化，可根据细胞骨架推测细胞所处生理阶段该实验设计简明、结果易得，但是对于细胞骨架的研究有许多不足：只能大概提供细胞骨架 形态分布的情况，不同种类细胞、同种类细胞在不同生理状态下、细胞不同部位的形态分布 则没有涉及；笼统地把不溶于去垢剂的物质作为细胞骨架，并且没有区分细胞骨架的不同成 分；处理中将细胞破坏，观察的是死细胞的细胞骨架，且可能已受到去垢剂的影响；不能观 察细胞骨架的重要特点——动态不稳定；不能观察细胞骨架与细胞器的相互关系。

综上，该 实验只是对细胞骨架的最初步研究，但也是最基本的研究对细胞骨架的深入研究要利用细胞培养，电子显微镜和荧光显微镜等技术参考文献〔1〕 杨军 等,洋葱花粉母细胞中胞间连丝和胞质通道内的胞质骨架,西北植物学报,2002，22（3）2〕 徐承水 徐来祥,试论细胞骨架,生物学杂志,1996，23〕 王新宇 郭风劲 聂秀菀,洋葱鳞茎茎肉细胞原生质体胞质骨架的荧光和电子显微镜观 察,西北植物学报,1997，17（1）Observation on Cytoskeleton of Onion Inner-epidermis CellHuang BinXie ZhuowenXu AnleZhong jianliangZou Tiansheng(School of Life science, ZhongShan University, Guangzhou 510275)【Abstract】 In this experiment, we destroyed most of the protein of onion inner-epidermis cells expect the cytoskeleton system by property concentration of TritonX-100, then stained and observed the cytoskeletonwith light microscope. By this, we carried out a primary study on distribution of cytoskeketon, membrane cytoskeleton ,nuclear cytoskeleton and plasmodesmata.Key Words】 cytoskeleton,light microscope,fiber,network。