琼脂稀释法操作步骤资料.ppt

琼脂稀释法操作步骤 原理： l将抗菌药物配制到琼脂培养基中成：128 ｕg/ml 、64ｕg/ml 、32ｕg/ml ……0.06ｕg/ml对倍稀释的浓度系列 l多点接种器将制备好的细菌菌悬液迅速点 种到琼脂表面,经35℃16-20小时培养 l肉眼观察细菌生长,以未见细菌生长平板 的最低药物浓度为最低抑菌浓度(MIC) 抗菌药物保存液的准备1 估算抗菌药物最小称量 l琼脂稀释法最高药物浓度为128ｕg/ml l药物和培养基的体积比1:14,即药物浓度将成 15倍稀释，因此保存液为 128ｕg/mlΧ15 = 1920ｕg/ml l如果1次用量为10ml ,则: 抗菌药物最小称量= 1920ug/ml*10ml 抗菌药物的效价 抗菌药物保存液的准备2 抗菌药物稀释 l选择合适的抗菌药物稀释液进行药物稀释 ,稀释液需要量见下列公式： l稀释液体积= 抗菌药物实际称量*效价 保存液浓度（1920ug/ml ） 抗菌药物保存液的准备3 实际操作： l先计算完成一批试验需几次完成,每次用 量多少,然后可一起称量,一起稀释,然后 按每次需要量分装在试管中,贴上标签,注 明药物名称,浓度,体积数及配制日期,置 与≤-20℃保存,备用。

培养基 需氧菌MH肉汤或琼脂 苛氧菌嗜血杆菌属：Haemophilus test medium base +补充因子SR158 链球菌属：MHA琼脂+5%脱纤维羊血 卡他莫拉菌属： MHA琼脂+5%脱纤维 羊血 淋球菌：CC Agar Base+L53 厌氧菌Wilkins chalgren anaerobe 琼脂 菌液准备1 生长法： l无菌环取4-5个菌落大小形态一致的菌落 顶部后接种于4-5mlMH肉汤内 l35℃ 培养4-6小时到对数生长期，亦可过 夜培养,但不允许超过18小时 l用肉汤/生理盐水校正至0.5麦氏管浓度1- 2X108CFU/ml 菌液准备2 直接菌落悬浮法： l从孵育了18-24h新鲜培养物的平板上，用 无菌环取单个菌落 l接种于无菌肉汤/生理盐水内 l校正至0.5麦氏管浓度1-2X108CFU/ml l推荐用于苛氧菌和潜在的MRS 菌液准备3 l对绝大多数细菌来说,上述用生长法或直 接菌落悬浮法制备的0.5麦氏浊度的菌悬 液,应该再用无菌肉汤或生理盐水行1:10 稀释,此时菌液浓度为1-2*107CFU/ml,调 整好的菌液应该在制备后的15分钟内完成 点种 菌液准备4 l如一次实验需完成50株或100株细菌,则细 菌要编上工作序号1-50或1-100,并在结果 记录纸上要一一对应写上工作序号和菌种 编号 琼脂稀释法药敏平板的制备 1 l配制融化的MH琼脂或适合其他苛氧菌、厌 氧菌等特殊细菌的培养基,待冷却到48- 50℃，浇制药物平板。

l取灭菌的90mm平板12只,用记号笔在平板 底部作好“点种标记”、“药物名称”、 “药物浓度”,浓度从0.06ｕg/ml……128 ｕg/ml,每种浓度1只平板共12个浓度系列 琼脂稀释法药敏平板的制备2 l取11支无菌玻璃试管(13Χ100mm),每支试 管标记为： 960,480,240,120,60,30,15,7.5,3.75,1. 875,0.935ｕg/m,并于上述每根管子中用 无菌移液管加无菌稀释液1.5ml 琼脂稀释法药敏平板的制备3 l将保存在≤-20℃冰箱中的1920ｕg/ml浓度的抗 菌药物保存液取出融化后,用无菌移液管吸取 2.5ml加入到128ｕg/ml标记的平板内1ml l移液管内剩余的1.5ml加入到960标记的试管内, 混匀后再吸取2.5ml加入到64ｕg/ml标记的平板 内1ml l移液管内剩余的1.5ml再加入到480ｕg/ml标记 的玻璃试管内;混匀后再吸取2.5ml l依次类推,直至最后一个0.06ｕg/ml标记的平皿 内加入1ml,则抗菌药物稀释完成 琼脂稀释法药敏平板的制备4 l准备2只无药的平板,作点种前和点种后质 控对照 l所有药物平板应保持表面干燥,不可有肉 眼可见的水珠(可在35℃孵箱内倒置平板 开盖烘干15-20分钟) 琼脂稀释法药敏平板的制备5 l如果需使用的药物平板为100Χ100mm的方平板, 则 每根玻璃管内需加入2.5ml的抗菌药物稀释液； 每次无菌吸管吸取的抗菌药物量应该为4.5ml 每只方平板应加入2ml抗菌药物试液 无菌吸管内应存留下2.5ml与下一个浓度的玻璃 试管内的2.5ml稀释液进行充分混匀 药敏培养基应加入28ml 测试菌液的点种1 l预先将点种针和点种板高压灭菌,并在孵箱内烘 干（52孔、100孔、或21孔） l将已调整好浊度(1-2Χ107CFU/ml)的菌液用微量 加样器将菌液依次加入菌液点种板小孔内,并作 好与药物平板相应的点种标记,一般每小孔内应 加入菌液270ｕl。

每批试验均须保留有质控菌 位置和无菌菌液位置 l用酒精棉球清洁多点接种器后，将点种针安装 在多点接种器架子上，再将加好菌液的点种板 安置上多点接种器的点种板位置上 测试菌液的点种2 l开启多点接种器进行点种，因每一根点种 针直径约3mm,因此点种到药物平板上每点 的菌液量约为2ｕl，所以接种量为104 CFU/点 l点种时应先点种对照前的质控平板，然后 从最低药物浓度开始点种依次点种到药物 浓度最高的平板 药物平板的孵育 l上述接种好的平板应在室温下静置至接种点上 的菌液被琼脂完全吸收，再将药敏平皿倒置， 于35℃孵育16-20小时 l如葡萄球菌苯唑西林和甲氧西林，则需33-35℃ ，绝对不能超过35℃，孵育24小时，阅读结果 l万古霉素药敏试验的肠球菌和葡萄球菌等需孵 24小时后，阅读结果 l淋病奈瑟球菌需在5%CO2空气环境中孵育20-24 小时，阅读结果 结果阅读和判断 l结果阅读时，平板应置于黑色不反光的表面上 ，记录的MIC是完全抑制细菌生长的最低抗生素 浓度，单个菌落或接种物所致的轻微的不清晰 现象可忽略不计 l如果在MIC判断终点附近持续存在或多个菌落， 或者低浓度不长，高浓度生长；或者有俗称的 跳管现象，就应该检查试验菌的纯度，有否污 染菌生长，并尽可能重复试验。

l按当年的CLSI/NCCLS标准判断结果 质 控 菌 株 质控菌株 药敏其他 金黄色葡萄球菌 ATCC29213 + 大肠埃希菌ATCC25922 + 大肠埃希菌ATCC35218 + 产β内酰胺酶 肺炎克雷伯菌 ATCC700603 + 产超广谱β内酰胺 酶 铜绿 假单胞菌 ATCC27853 + 质 控 菌 株 质控菌株 药敏其他 肺炎链球菌 ATCC49619 粪肠 球菌 ATCC29212 + 检测 胸腺嘧啶 流感嗜血杆菌ATCC49766 + 氨苄西林敏感株 流感嗜血杆菌ATCC49247 + 产β内酰胺酶(-) 氨苄西林耐药株 淋病柰瑟球菌：ATCC49226 + 厌氧菌 ATCC25285 + 常见问题及解决指南 抗菌药现象可能原因解决办法 氨基糖苷类MIC太高培养基PH太低PH范围7.2-7.4避 免CO2孵育降低PH 喹诺酮类MIC太低培养基PH太高PH范围7.2-7.4 多种药物跳管污染、管内接种物不 正确、药物浓度错 误、肉汤体积错误 重复QC试验 使用新批号培养基 l抗菌药物最小称量= 。