第九章蛋白质组学修v学习资料.ppt

第九章 蛋白质组学 (Proteomics)第一节 概述 蛋白质组的概念及发展简史n20世纪生命科学的辉煌成就：20世纪上半叶，以遗传学为代表， 以DNA双螺旋结构的提出而告捷；20世纪下半叶，以分子生物学为代表， 以“中心法则”的问世而集大成；20世纪90年代， “人类基因组计划（HGP） ” 基因与其编码产物蛋白的非线性关系遗传信息从DNAmRNA结构蛋白质和功能蛋白质，构成一种有机体，完成生命的功能 基因 mRNA蛋白质，三位一体，构成了遗传信息的流程图，这即是传统的中心法则ProteinproductionpathwayHumangenomicsequencesmRNAProteinproductFunctionalproteinproductionTranscriptioalcontrolTranslationalcontrolPost-translationalcontrolmRNAtellsuswhatmighthappenProteometellsuswhatishappen 基因组(genome) 转录组(transcriptome) 一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的mRNA. 蛋白质组(proteome) 一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质称为蛋白质组.2021/12/28n后基因组时代功能基因组学成为研究重心蛋白质组学是其“中流砥柱”，成为战略制高点从基因组学到蛋白质组学 Sequence databasesGenomeWhat could happenGene ExpressiondatabasesTranscriptome+What would happenProtein ExpressiondatabasesProteome+What is happeningRelational Query Toolsn人类基因组计划（HGP）：90年代，随着全球性基因组计划尤其是人类基因组计划（HGP）规模空前、速度惊人的推进，基因研究已接近“登峰造极”，人类对生命的理性认识达到了前所未有的深度和广度。

2021/12/28n蛋白质组计划：基因组功能的阐明已经摆在面前，生命科学几乎在转瞬之间开始了新的征程蛋白质组计划，进入了一个新的纪元后基因组时代国际人类蛋白质组组织2021/12/28以往人类对于蛋白质的研究只是针对生命活动中某一种或某几种蛋白质，难以形成一种整体观，难以系统透彻地阐释生命活动的基本机制基因是遗传信息的源头功能性蛋白是基因功能的执行体大规模、全方位的蛋白质研究势在必行蛋白质组学的提出及其意义蛋白质组(proteome)：一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质蛋白质组学(proteomics)：指研究蛋白质质组组的技术术及这这些研究所得到的结结果，其内容包括蛋白质鉴定、翻译修饰、蛋白质功能确定、蛋白质与疾病的关系、蛋白质相互作用2021/12/28蛋白质组的动态概念：不仅在同一机体的不同组织和不同细胞中不同，而且在同一机体的不同发育阶段、不同生理或环境下表现不同 2021/12/282 意义n每一种生命运动形式，都是特定蛋白质群体在不同时间和空间出现，并发挥功能的不同组合的结果基因 DNA的序列并不能提供这些信息，所以仅用核酸的语言不足以描述整个生命活动n蛋白质组学是连接基因、蛋白质和疾病的纽带，对蛋白质表达的变化或差异的分析将具有重要的生物学意义和医学应用价值，为阐明生命现象的本质奠定基础。

2021/12/28n由于基因剪接，蛋白质翻译后修饰和蛋白质剪接，基因遗传信息的表现规律就更加复杂，不再是经典的一个基因一个蛋白的对应关系n一个基因可以表达的蛋白质数目可能很大对细菌，可能为1.21.3；对酵母则为3；而对人，这个因子可高达102021/12/28One Genome Many Proteomes 2.1蛋白质鉴定：n 可以利用一维电泳和二维电泳并结合Western等技术，利用蛋白质芯片和抗体芯片及免疫共沉淀等技术对蛋白质进行鉴定研究 第二节 蛋白质组学的研究内容2021/12/28 2.2蛋白质功能确定： 可以利用基因敲除和反义技术分析基因表达产物-蛋白质的功能另外对蛋白质表达出来后在细胞内的定位研究也在一定程度上有助于蛋白质功能的了解Clontech的荧光蛋白表达系统就是研究蛋白质在细胞内定位的一个很好的工具2021/12/282.3蛋白质与蛋白质的相互作用 n对于阐明细胞乃至整个生命活动的分子机制具有举足轻重的意义细胞的任何活动都需要蛋白质分子与蛋白质分子、蛋白质与其他分子的相互作用，这也是调节细胞反应适度的必要条件n如分析酶活性和确定酶底物，细胞因子的生物分析/配基-受体结合分析。

2.4蛋白质的丰度变化 n即各种蛋白质的识别和定量化，是对不同状态细胞的蛋白质差异表达进行比较，一般是指某种蛋白质在细胞内表达的相对含量的变化AB 2.5翻译后修饰 很多mRNA表达产生的蛋白质要经历翻译后修饰如磷酸化，糖基化，酶原激活等翻译后修饰是蛋白质调节功能的重要方式，因此对蛋白质翻译后修饰的研究对阐明蛋白质的功能具有重要作用 目前主要研究较多的为蛋白质磷酸化，糖基化2021/12/282.6蛋白质分布 n不同发育、生长期和不同生理、病理条件下不同的细胞类型的基因表达是不一致的，因此对蛋白质表达的研究应该精确到细胞甚至亚细胞水平 2.7药物的靶分子的确定： n 蛋白质组学的研究最终要服务于人类的健康，主要指促进分子医学的发展如寻找药物的靶分子很多药物本身就是蛋白质，而很多药物的靶分子也是蛋白质药物也可以干预蛋白质-蛋白质相互作用n 在基础医学和疾病机理研究中，这些研究可能找到直接与特定生理或病理状态相关的分子，进一步为设计作用于特定靶分子的药物奠定基础 2021/12/28蛋白质组学的难点 n蛋白质组的多样性 n蛋白质的种类确定 n蛋白质组的动态性 n蛋白质组的时空性 n蛋白质组学的技术 第三节 蛋白质组研究方法蛋白质组研究的三大基本支撑技术 |双向电泳技术（2DE）|计算机图像分析与大规模数据处理技术|质谱技术(MS) 蛋白质组研究方法|双向电泳技术：固定化pH梯度胶的出现，改善了双向电泳的重复性及上样量。

质谱技术：电喷雾质谱和基质辅助激光解析飞行时间质谱技术的发明及发展n生物信息学的创立及其迅速发展：计算机图像分析与大规模数据处理技术2021/12/28 3.1 蛋白质分离纯化技术n双向电泳技术n（two-dimension electrophoresis,2DE）n 2021/12/28n 双向电泳n原理n在双向电泳中，第一向通常根据蛋白质等电点的不同进行等电聚焦电泳（IEF），然后再根据分子量的不同进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）作为第二向双向电泳技术是蛋白质组学研究中蛋白质多肽链分离纯化和鉴定的主要实验技术之一常用双向电泳设备第一向等电聚焦电泳系统 第二向中等通量垂直电泳系统样品制备（Samplepreparation）固相预制胶条的水化（IPGstriprehydration）第一向等电聚焦（IEF）胶条的平衡（IPGstripequilibration）第二向SDS-PAGE电泳（SDS-PAGE）凝胶的染色及检测（Detection/Staining）PDQuest等软件分析（Softwareanalysis）双向电泳实验流程 等电聚焦电泳（isoelectric focusing, IEF）n 根据不同蛋白质的等电点不同，将蛋白质加到含有不同pH值的两性电解质的聚丙烯酰胺凝胶中，蛋白质样品在此凝胶中移动到与其等电点相同的pH梯度处后净电荷为零，在凝胶中不再移动，也就是相同等电点的蛋白质聚焦在相同pH梯度处，从而把不同等电点的蛋白质分开。

pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 102-D ElectrophoresisThe 1st D: Isoelectric Focusing(IEF)IEF Theory10 or 20 FractionsAmpholytes generate pH gradient (pH 3-10)7.59.57.5pI 4.57.57.57.5pI 4.59.59.59.59.5pI 4.5 3 4 5 6 7 8 9 10 Anode(+)Cathode(-)ACIDBASEProteins Migrate to their pI ( 0 net charge)IEF Theory10 or 20 FractionsHarvest with Vacuum Source7.59.57.5pI 4.57.57.57.5pI 4.59.59.59.59.5pI 4.5 3 4 5 6 7 8 9 10 Anode(+)Cathode(-)ACIDBASEThe Rotofor SystemA) Inject sampleB) Apply currentC) Focus proteinsD) Harvest fractions双向电泳-第二向(SDS-PAGE)+pH 3pH 7.5pH10pH 3pH 7.5pH10chargesizeThe2ndD:SDS-PAGEProteins migrate through the gel at a rate proportional to their size.Smallest proteins travel the furthest distance单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式*38一、样品制备样品制备基本原则n使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），制备方法应具有可重现性。

n防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀n防止在样品制备过程中发生样品抽提后的化学修饰（如酶性或化学性降解等）n完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白n尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性样品制备（一）n细胞样品：反复冻融、超声破碎n组织样品：碾磨、匀浆n植物样品：碾磨n分泌蛋白 蛋白质样品的浓缩、去除滤液中的高丰度蛋白n菌体蛋白 裂解液处理、超声破碎双向电泳样品的溶解n是成功进行双向电泳的最关键因素之一n溶解的目标：n样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液；n必须将可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除；n保证样品在电泳过程中保持溶解状态增加样品溶解性的手段离液剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域典型代表是尿素和硫尿去垢剂：经过离液剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种去垢剂来溶解疏水基团常用的去垢剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP-40、两性离子去垢剂CHAPS、OBG等其中CHAPS应用最普遍还原剂：在离液剂和去垢剂联用条件下，加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。

常用含自由巯基的DTT或-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦（TBP）进行还原两性载体电解质： 即便在离液剂和去垢剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀 两性载体电解质的作用在于补充样品中少量的盐分，从而保证蛋白质的溶解性应用时，两性电解质的浓度应小于0.2（w/v)浓度过高会使IEF的升压困难、速度降低样品中核酸的去除n对电泳的影响：增加样品粘度、与蛋白质形成复合物后会出现假象迁移和条纹n解决方法：n用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切酶进行降解，或是利用合成载体两性电解质（SCA）同核酸结合形成复合物的能力，再通过超速离心来去除复合物nReadyPrep 2-D cleanup kit 二、适用于质谱的染色方法 考马斯亮兰（Coomass。