血清蛋白的分离——.ppt

聚丙烯酰胺凝胶电泳法 (1) 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 (2) 掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板及 圆盘电泳的操作技术聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载 体的一种区带电泳该凝胶由丙烯酰胺（Acr ）和交联剂N，N—甲叉双丙烯聚酰胺（Bis） 聚合而成聚丙烯酰胺凝胶电泳利用电泳和分 子筛的双重作用分离物质Acr和Bis单独存在或混合在一起时是稳定的， 但在具有自由基团体系时就能聚合引发自由 基团的方法有化学法和光化学法两种化学法 的引发剂是过硫酸胺（Ap），催化剂是四甲基 乙二胺（TEMED）；光化学法是以光敏感物 核黄素来代替过硫酸胺，在紫外光照射下引发 自由基团聚丙烯酰胺凝胶电泳的凝胶体系有连续和不 连续电泳之分不连续电泳系统由浓缩胶和 分离胶两种胶体组成，两种胶体分别由不同 的pH 的缓冲液和胶贮液配制而成，形成孔 径不同的两种胶体不连续电泳系统电泳分 离过程中包括三种物理效应，即样品的浓缩 效应、电泳分离的电荷效应和凝胶的分子筛 效应本次试验采用不连续电泳系统PAGE，通过 三种效应将血清中各蛋白质组分按其分子大 小、电荷多少不同进行分离聚丙烯酰胺凝胶电泳有圆盘电泳和垂直 板电泳之分，但两者的原理完全相同， 只是所用的电泳槽不同。

由于时间问题，本次试验将分两组进行 ，一组使用圆盘，一组使用垂直板夹心式垂直板电泳槽，圆盘电泳槽，电泳仪，直 流稳压电源，玻璃板（13×13），注射器及微量注 射器抽气泵，干燥器，培养皿，玻璃棒，吸量管，烧 杯，滴管，玻璃管，薄膜手套，滤纸，日光灯制备分离胶、浓缩胶有关试剂：凝胶缓冲液，分离胶贮存液，0.8%过硫酸铵；浓缩胶缓冲液，浓缩胶贮存液，40%蔗糖溶液， 核黄素Tris-甘氨酸电极缓冲液（PH8.3）已加入溴酚蓝指示剂的血清样品染色液（氨基黑）1%琼脂（糖）溶液脱色液（7%乙酸溶液）由学生自己配制一、垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳 1.凝胶的制备： （1）安装夹心式电泳槽将长短玻璃板分别插到U形硅橡框的凹 形槽中（注意勿用手接触灌胶面的玻璃），在 长玻璃板下端与硅胶橡框交界的缝隙内加入已 融化的1%琼脂糖且两玻璃板内下端处处有琼脂 糖（其目的是封住空隙，凝固后的琼脂中应避 免有气泡），琼脂凝固后，将硅胶橡框装入电 泳槽内，以对角线的方式将螺丝帽旋紧试剂名称 用量（ml)分离胶缓冲液（ph8.9 ）2.5ml分离胶凝胶贮液 5.0ml蒸馏水 2.5ml将以上三种试剂混合均匀后 ，置于真空干燥器中抽气10min过硫酸铵，置于真空干燥器 中，抽气10min10.0ml按上表格配胶，二者抽气后混合均匀，小心不 要在溶液中搅出气泡，以免过多接触空气。

迅速用滴管将混合后的分离胶装在二块玻璃板 之间至短板上端约3-4cm，并用注射器在起上 面加一层水约1mm使凝胶形成时有一水平面， （注意加水时，不要引起胶面的大波动）在室温中放置，当两界面出现不同折射率时表 明已凝胶，时间大约40 分钟，以出现折射率不 同的界面为准，再室温下放置十分钟，使凝胶 充分将分离胶上层的水倒去，再用滤纸吸去多余的 水（注意不要碰破胶面），为下一步做准备试剂名称用量（ml)浓缩胶缓冲液（ph6.7) 0.5ml浓缩胶贮液 1.0ml40%蔗糖 2.0ml将以上三种试剂混合均匀后， 置于真空干燥器中，抽气10min核黄素 0.5ml按上表所示配胶，抽气后加核黄素0.5ml,混匀 ，立即加入到已配制好的分离胶上面至短玻璃 板上端约0.5cm，插入加样梳，放于日光灯下 10 分钟左右浓缩胶就开始凝胶，30~50分钟左 右凝好（凝缩胶变为乳白色为准），凝好后小 心拔去加样梳将 Tris—甘氨酸电极缓冲液稀释10 倍后倒入电泳 装置的左、右槽中，短玻板一侧要稍微超过玻板 ，长玻板一侧只要越过电泳丝的高度用微量注射器通过缓冲液在每个加样凹槽中加入 约5ul的样品。

将样品端(短玻璃的一边)接直流稳压电泳仪 的负极，接通冷却水，开始电泳开始时电流控制在10mA，待样品进入分离 胶时，将电流调至30mA左右当蓝色染料 迁移至距离橡胶框下缘琼脂界面处0.5cm 左 右时，电泳完成将缓冲液回收至试剂瓶中，还可用1-2 次（ 注意将正负级的缓冲液分开回收）4.剥胶将固定螺丝旋松，取出硅橡胶框，将一块 玻璃板轻轻剥开，然后用玻璃棒将胶板取下 放入培养皿中5.固定，染色在培养皿中倒入氨基黑染色液至覆盖胶板 ，染色分钟左右，此时染色与固定同时进行 染色液要回收利用）6.脱色用 7%乙酸浸泡数次，直至背景蓝色脱去1.凝胶的制备：（1）安装圆形玻管将洗净的玻璃管烘 干后用橡胶玻璃头封 严，放置在一边等待 灌胶2) 分离胶制备  按垂直板的方案进行配胶，混匀后迅速用 滴管分装在玻璃管中至玻璃管上端约2-3cm， 并用注射器在起上面加一层水约1mm使凝胶形 成时有一水平面，在室温中放置，当两界面出 现不同折射率是表明已凝胶，将分离胶上层的 水倒去，再用滤纸吸去多余的水（注意不要碰 破胶面），为下一步做准备。

(3) 浓缩胶制备（同垂直板）：按垂直板的方案进行配制，配制好后，立 即加入到已配制好的分离胶上面至短玻璃板上 端约1cm，然后放于日光灯下10 分钟左右浓缩 胶就开始凝胶，30~50 分钟左右凝好（凝缩胶 变为乳白色为准）2.加样将 电极缓冲液稀释10 倍后倒入电泳装置的上.下槽 中（注意需没过玻璃管的上下端），用微量注射 器通过缓冲液在每个玻璃管的凝胶表面加约5ul 的 样品 3.电泳将样品端(上槽)接直流稳压电泳仪的负极，下槽接 直压电泳仪的正极开始时电流控制在1-2mA/管 ，待样品进入分离胶时，将电流调至5mA 左右/管 当蓝色染料迁移至距离玻璃管下缘1-2cm 左右时 ，停止电泳将缓冲液回收至试剂瓶中（注意正 负极分开回收）4.剥胶将玻璃管从电泳槽中取下，用注射器吸满自来水 后将针头插到凝胶与管壁之间，推动注射器，使 针头在管壁和胶之间前进，胶条在水的压力及润 滑的作用下自玻管中脱出，将其放入培养皿中 5.固定，染色，脱色（同垂直板）由于与凝胶集合有关的硅橡胶条、玻璃板表面 不光滑洁净，在电泳时会造成凝胶板与玻璃板 或硅橡胶条剥离，产生气泡或滑胶；剥胶时凝 胶板易断裂，为防止此现象，所用器材均应严 格地清洗。

安装电泳槽和镶有长、短玻璃板的硅橡胶框时 ，位置要端正，均匀用力旋紧固定螺丝，以免 缓冲液渗漏 用琼脂（糖）封底及灌凝胶时不能有气泡，以 免影响电泳时电流的通过灌胶时，若担心琼脂封底不牢固，则可在上、下 贮槽中倒入蒸馏水，液面上面不能超过上贮槽的 短玻璃板，防止蒸馏水进入凝胶中其作用是增 加压力，防止凝胶液渗漏浓缩胶凝胶完全聚合后，必须放置30min左右，使 其充分“老化”后，才能轻轻取出样品槽模板，切勿 破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳后扭曲（凝 胶加“老化”整个过程用时大约50分钟）电泳时，电泳仪与电泳槽间正负极不能接错，以 免样品反方向泳动电泳后，应分别收集上、下贮槽（正负极）电极 缓冲液，切不可混合回收染色液要及时回收垂直板电泳结果：圆盘电泳结果：谢谢大家！祝大家试验成功！！ ！。