2022生物2022蛋白质与生物大分子的相互作用研究.ppt

蛋白质与生物大分子的相互作用争论张雪梅检验医学院.基因的功能争论成为热点，争论的对象即为基因编码的产物蛋白质，生物功能的主要表达者和执行者；在全部生命活动中，细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调剂其基因的表达，以保持其生物学特性，这其中必需涉及蛋白与蛋白，核酸的相互作用；把握或制造争论相互 作用的方法特殊重要；.nucleus cytoplasm .主要内容n免疫共沉淀(Co-IP)：蛋白蛋白，蛋白DNAnPulldown（亲和层析）：蛋白蛋白，蛋白DNA/RNAn电泳迁移试验(EMSA)：蛋白DNA/RNAn酵母双杂交系统：蛋白（X）蛋白.用途：鉴定两种目标蛋白质是否在体内结合，结合位点分析；选择一种特定蛋白质的新的作用搭档；原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的很多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来；假如用蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那么与x在体内结合的蛋白质y也能沉淀下来；一，免疫共沉淀（in vivo）Co-Immunoprecipitation，Co-IP.Co-IP工作原理示意图Co-immunoprecipitationbindingwashelutionYYYYYWestern blot 鉴定PAGE质谱细菌蛋白质的“protein A”可特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段.Co-IP鉴定蛋白相互作用.试验原就n 细胞裂解接受温存的裂解条件（NP40，Triton-X100等）；每种细胞的裂解条件是不一样的，通过体会摸索确定；n 确保共沉淀的蛋白是由所加入的特异性抗体沉淀得到的，而并非其他非特异蛋白：n 1，使用单克隆抗体：多抗？n 2，使用对比样本或抗体（同型抗体）.Structural basis of G proteincoupled receptorG protein interactions；Nature Chem Biol,2021,6:541-548（分析蛋白相互作用的位点）大鼠G蛋白耦联受体M3R G蛋白（绿色）（蓝色）（紫色）亚基.G蛋白藕联受体信号转导示意图.将不同变异体的表达质粒共转染入cos-7细胞中，单独转染的为对比；左图为IP前的IB,右图为IP后的IB，二者复合物为80kD（阳性结果）；图为两次独立试验的其中一次；.TAK-242(Resatorvid),a Small Molecule Inhibitor of Toll-Like Receptor(TLR)4 Signaling,Binds Selectively to TLR4 and Interferes with Interactions between TLR4 and Its Adaptor Molecules.Mol Pharmacol,2021,79:34-41（鉴定）分析靶蛋白与小分子化合物的作用：The immunoprecipitates were separated using SDS-PAGE limmunoblotting with anti-FLAG M2 mAb or anti-HA tag mAb.lanalyzed using autoradiography.TRAM分析小分子化合物对蛋白相互作用的干扰.Screening of ClpE interaction proteinsScreening of ClpE interaction proteinsnConstruct recombinant plasmid pAE03-ClpE and transform into S.pneumoniae D39 nWestern blot for identificationnCo-Immunoprecipitation(Co-IP)transfer 1ml（OD600=0.5-0.6）cleared lysate of D39 and D39-ClpE-GFP to a 10ml beaker separately.Add 500l protein G-agarose beads(GE),incubate for 3h at 4 on a rotating apparatus with magnetic stirrer to remove non-specifically bound proteins.Add 800l protein G-agarose beads and 2025g GFP antibody(Clontech)to the supernatant.Incubate overnight at 4 on a rotating apparatus.Wash beads five times with 1 ml PBS for 2 min each wash.Resuspend pellet in 50-80l 2 SDS sample buffer.Load 1015 l of supernatant on an SDS/polyacrylamide gel.FtsW与与ClpE的相互作用鉴定的相互作用鉴定A：IP前前GFP多抗检测多抗检测 1.D39，2.D39（FtsW:GFP)B：IP后后ClpE多抗检测多抗检测 1.rClpE，2.D39，3.D39(FtsW:GFP)C：IP前前ClpE多抗检测多抗检测 1.rClpP，2.D39，3.D39(FtsW:GFP).优点：相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于自然状态；蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以防止人为的影响；难点：需要高质量的抗体进行IP；两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；检测不到弱或瞬时的相互作用；.应用：分析与蛋白质相互作用的DNADNA序列序列信息染色质免疫共沉淀（Chromatin Immuno-precipitation,ChIP）.Chip-seq技术技术 可获得数百万条序列标签，并能把所关注的蛋白的DNA结合位点精确定位到基因组上；华大基因，上海生物芯片有限，上海康成生物有限公司等 2007 2021 2021 2021 2021 2021 2021.Genome-Wide Mapping of in Vivo Protein-DNA Interactions.Science,2007,316(5830):1497-1502 Johnson等利用 ChIP-seq 对转录因子NRSF(神经元限制性缄默因子)在DNA上的结合位点进行了全基因组的筛查:结果：获得了1946个结合位点；结合位点的最小能辨论为50bp；.获得的经典与非经典的神经限制性缄默元件(NRSE)序列；.高质量的ChIP-seq结果供应了争论新的DNA-蛋白相互作用的内容，发觉其为胰岛发育调控网络中的重要转录因子；.NUCKS is a positive transcriptional regulator of insulin signaling.Cell Rep.2021 Jun 26;7(6):1876-86 NUCKS(nuclear ubiquitous casein and cyclin-dependent kinasesubstrate)：脊椎动物中广泛表达的一种可被多种激酶磷酸化的高磷酸化蛋白；.二，Pull-down试验（in vitro）用途：1.鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用 2.选择与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质原理：利用GST，HIS等标签蛋白将一种蛋白质（诱饵蛋白）固定于某种基质上(如Sepharose)，当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，通过转变洗脱液或洗脱条件即可回收所吸附的蛋白；.洗脱洗脱（2）结合结合（3）检测检测（6）收集收集（5）洗脱洗脱（4）固定诱固定诱饵蛋白饵蛋白（1）.The Polymeric Immunoglobulin ReceptorTranslocates Pneumococci across Human Nasopharyngeal Epithelial Cells.Cell,2000,102:827837（鉴定）npolymeric immunoglobulin receptor(pIgR)nCbpA nThe hpIgR-mediated bacterial adherence and invasion were abolished by either insertional knockout of cbpA or antibodies against either hpIgR or CbpA.methodsn蛋白表达：Expression of CbpA Polypeptides(6His）nPull-down：Affinity Purification of the CbpA Binding Proteinsn蛋白鉴定：Proteins in the fractions were analyzed by SDS-PAGE and IB，and N-Terminal Sequencing of the CbpA Binding Proteins.nrCbpA Covalently conjugated to 1 ml of Affi-Gel 15(BioRad)in 0.1 M MOPS(pH 7.5)at 4；nThe column was sequentially washed with washing buffer；nDetroit cells surface proteins were labeled with Sulfo-NHS-LC-biotin；nCell lysates were prepared in a buffer containing protease inhibitors；nCellular debris was removed by centrifugation at 4，The supernatant was recycled through the CbpA1-affinity column for 4 h at 4；nwash the column with washing buffer；nthe bound proteins were eluted in 300 ml fractions with 100mM glycine-HCl(pH 2.5)；.进一步鉴定hplgR与CbpA结合的区段及是否需要糖基化n rCbpA were immobilized on carboxylated latex beads.n Latex beads coated with CbpA polypeptides were resuspended in 100l of PBS/Mg2+/Ca2+and 0.1%Triton X-100,and mixed with 100l of hSC（plgR胞胞外部分）外部分）.n Unbound proteins were removed by extensive washing buffer.n The beads were then resuspended in SDS-PAGE loading buffer to solubilize bound proteins.n Proteins were separated in SDS-PAGE gels and detected by IB.CbpA与hplgR结合区段的鉴定 Vncs为S.pn的另一种膜蛋白，hSC为表达hplgR的MDCK细胞，Neo为不表达hplgR的MDCK细胞；.Pull-down的优缺点n优点：n灵敏，周期短n抗体质量要求不高n可鉴定直接相互作用n缺点：n需要纯化的蛋白n体外相互作用（假阳性，假阴性）E直接结合试验二抗二抗一抗一抗YX.DNA/RNA Pull-down 试验n应用：主要用于选择，鉴定与目的DNA。