Gene32蛋白对PCR产量的影响.doc

Gene32蛋白对PCR产量的影响临床检验杂志 1999年第3期第0卷 临床化学作者：李经忠　孟红　郭进林单位：山东省医学科学院基础医学研究所，250062关键词：Gene32蛋白；PCR　　在临床检测和科研中，有时因引物对原因，PCR产量低，不利于结果观察在PCR检测血清HBV基因的同时，加入Gene32蛋白，提高了PCR产量和灵敏度 　　1　材料与方法　　1.1　基因32蛋白(Gene32 protein)(Pharmacia)，2.5 mg/ml　　1.2　Taq DNA聚合酶(华美公司)　　1.3　dNTPs(华美公司)：dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5 mmol/L　　1.4　提取的乙肝血清核酸(应用白蛋酶K/酚/氯仿法)　　1.5　10×Taq聚合酶缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，500 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2，0.01 g/dl gelatin)　　1.6　乙肝基因引物　上游引物：H1，5′-CCATACTGCGGAACTCCT-3′，起始于HBV基因组的聚合酶基因的1267位点［1］，下游引物H2，5′-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3′，起始于HBV基因组X基因的1546位点。

此引物对扩增的特异产物大小为279 bp，对四种血清型的HBV均适用引物由上海生工生物技术公司合成　　1.7　方法　5 μl 10×Taq聚合酶缓冲液，4 μl dNTP，5μl 10 μmol/L H1引物，5 μl 10 μmol/L H2引物，5 μl血清HBV核酸，26μl双蒸水，2 U Taq DNA聚合酶混合在一起，共制备4管反应液第一管加入0.5μl Gene32蛋白，第二管加入0.25 μl Gene32蛋白，第三管加入0.125μl Gene32蛋白，第四管未加每管加入25 μl液体石蜡，离心后加在PCR热循环仪上程序如下：94℃，变性5 min；30个循环：每个循环包括94℃变性1 min，54℃复性50秒，72℃延伸1 min；末梢延伸72℃ 5 min反应产物在2 g/dl琼脂糖(含0.5 mg/L溴化乙锭)，1×TAE电泳缓冲液中电泳，每份取10μl反应产物加2 μl 6×上样缓冲液(30%甘油＋0.25 g/dl溴酚蓝)，5 v/cm，电泳30 min，观察结果　　上述4管PCR反应产物各取40 μl用PCR产物纯化试剂盒(上海华顺公司)纯化，去除多余引物、酶、无机盐、矿物油、dNTP等，后经7530-G uV-VIS光谱仪分析结果。

　　2　结果　　4管产物的电泳结果见附图,可见在50 μl的反应体系中,加入1.25μg和Gene32蛋白可大大提高PCR产量,有利于HBV基因的检出　　4管产物的纯化产物,经光谱仪分析各为11 μg/40 μl、4.1 μg/40μl、2.1 μg/40 μl、1.2 μg/40 μl在50 μl反应体系中,加入1.25 μg的Gene32蛋白，与不加者相比，产量可提高近10倍　　第1道，pBR322/Msp I ladder第2道，为加入0.5μl(2.5 mg/ml)的Gene32蛋白的PCR反应产物第3道，加入0.25 μl(2.5 mg/ml)的Gene32蛋白的反应产物第4道，加入0.125 μl(2.5 mg/ml)的Gene32蛋白的反应产物第5道未加Gene32蛋白附图　Gene32蛋白对PCR产量的影响　　3　讨论　　Gene32蛋白是一个单链核酸结合蛋白,由T4噬菌体基因32(Phage t4 gene32)编码它对T4噬菌体DNA的复制是必需的,通过结合在单链区起协同作用,对双链的螺旋结构有去稳定性的作用[2]　　克隆的基因32蛋白可提高T4DNA聚合酶活性[3,4],改善限制性酶的酶切作用[4]。

Gene32蛋白在电子显微镜下,可区分单链和双链核酸[6]基因32蛋白尚可用于识别受损的DNA[7]Schwarz等报道,应用基因32蛋白可使长链PCR产物的产量至少提高10倍[8]　　参考文献　　[1]Ono Y,Onda H.Sasoda R,et al.Nucleic Acids Res，1983，11：1747～1757　　[2]Williams K R.et al.J Biol Chem，1981，256：1754　　[3]Huberman J A，Kornberg A. J Mol Biol，1971，63：39　　[4]Topal M D，Sinha N K.J Biol Chem，1983，258：12274～12279　　[5]Dombroski D F,Morgan A R.J Biol Chem，1985，260：414　　[6]Wu M,Davidson N.Proc Natl Acad Sci USA，1975；72：4506　　[7]Williams K R,et al.J Biol Chem，1981，256：1754　　[8]Schwarz K,Hansen-Hagge T,Bartram C.Nucleic Acids Res，1990，28(4)：1079(1998-05-13收稿) 。