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探讨不同物理方法分离脂肪源基质血管组分细胞的差异文章快速阅读：文题释义：脂肪源基质血管组分：是指来源于脂肪组织的基质血管组分细胞，它广泛存在于脂肪组织中，主要包含脂肪来源干细胞、内皮祖细胞、造血干细胞、抗炎细胞、T细胞等混合细胞成分由于它相对较易获取且对供体不会造成过大的损伤，同时可以避免细胞培养等优点，被认为是干细胞医学良好的细胞来源物理方法：酶解法为国际公认的富集基质血管组分的方法，但加入了外源性消化物质，国际上不允许用于临床试验，故使用不加入外源消化物质的物理方法获取基质血管组分即成为了研究的主要方向大量研究从脂肪组织中分离得到富含细胞的成分，并将其命名为基质血管组分[1]，通过系列研究证实基质血管组分中的细胞成分具有多细胞系分化能力，血管基质组分包含基质细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、周细胞、免疫细胞以及大量血液循环来源的细胞，比如白细胞、红细胞等，是细胞辅助脂肪移植中最重要的组分[2,3]研究表明，通过吸脂得到的脂肪组织经过一系列处理，分离纯化得到的细胞成分经过体外培养可以贴壁生长，在合适的条件下这些细胞可以向成骨、成脂、成肌方向分化[4,5,6]；同时基质血管组分细胞能在整形美容、心肌瘢痕、支气管注射治疗、肾病治疗、骨再生等方面发挥重要作用[7,8,9]。

基质血管组分来源丰富、取材方便，能直接从脂肪组织中分离，无免疫排斥反应，具有非常好的研究和应用价值[10,11,12,13,14]OSINGA等[15]使用类似的机械方法制备脂肪移植材料，但是其过程只改变了脂肪抽出物的宏观结构而不是微观结构，此外没有发现细胞数目、存活性、脂滴数量、血管结构或细胞组成比例的差异YAO等[16]用推注法破碎大多数成熟的脂肪细胞制备出富含基质血管组分细胞的脂肪组织干细胞凝胶，达到了富集基质血管组分细胞及细胞外基质的目的，其中基质血管组分中含有大量具有生物学活性的脂肪源性干细胞，并且保留了基质血管组分黏附在细胞外基质上的生理关系，使得基质血管组分浓缩的同时，更加容易定植在移植区域[17,18,19]作者在研究过程中发现普通推注法出现了炎症反应，推测其碎片率可能会偏高，而当前分离脂肪源基质血管组分的方法主要就是酶解法和推注法，酶解法是在实验过程中加入外源性消化酶，在国际上不允许被运用于临床研究，而普通推注法操作繁琐，且利用该方法制得的基质血管组分中细胞碎片率偏高，活细胞率偏低，引发炎症的潜在风险较高，故作者将原有的推注法进行了改良并提出了3种新的制备基质血管组分的物理方法，一种是在原有操作步骤上进行改良后得到的改良推注法，一种是利用玻璃珠破碎制备基质血管组分细胞的方法，还有一种是利用内置式超声波破碎脂肪组织制备基质血管组分细胞的方法[20,21,22,23]。

改良推注法运用机械破碎原理破碎脂肪组织中成熟脂肪细胞，富集基质血管组分细胞基质血管组分细胞中含有大量的、具有超强生命活性的脂肪干细胞及免疫细胞，而脂肪干细胞作为脂肪组织的储备可直接转化为脂肪细胞，并且保留了基质血管组分细胞黏附在细胞外基质上的生理关系，同时改良推注法不加入外源性化学物质，制备过程较为简易、花费成本较低玻璃珠破碎法(简称玻璃珠法)是利用玻璃珠震荡产生的机械剪切力来破碎成熟脂肪细胞，这种震荡产生的机械剪切力相对于推注来说较小，对目标细胞的损伤较小，很好地保证了基质血管组分细胞的活性，且不会造成太多的细胞碎片[24,25,26,27,28,29,30,31,32,33]内置式超声波破碎法(简称内置超声波法)利用空化效应产生的空化核对脂肪组织进行破碎，产生的机械力同样对目标细胞损伤较小，保障了目标细胞的细胞活性，同时不会产生过多的细胞碎片，大幅减小了产生炎症的风险通过比较这几种物理方法，希望寻找到一种更加高活性、安全、简便的制备脂肪源基质血管组分的方法1、材料和方法1.1设计细胞学体外实验1.2时间及地点实验于2018年1月至2019年1月在华南农业大学生命科学学院广东省农业生物蛋白质功能与调控重点实验室完成。

1.3材料1.3.1脂肪组织实验所用人体脂肪组织均由广州中家医家庭医生整形美容医院提供，体检无其他疾病，取材前均获知情同意并通过伦理审批，均为脂肪抽吸术所得脂肪颗粒正常成年人的体质量指数值在18.5-23.9kg/m2之间[26,27]随机取36位进行脂肪抽吸术患者，均为女性，年龄18-35岁，平均年龄26.8岁，体质量指数值为24.0-32.0kg/m2，平均体质量指数值29.2kg/m2，均属于过重或肥胖抽吸出大腿部脂肪，每位患者抽吸的脂肪量为200-400mL，平均(308.3±50.6)mL1.3.2实验试剂、仪器0.4%锥虫蓝、乳酸脱氢酶细胞活力检测试剂盒、CCK-8细胞增殖率检测试剂盒(IBL公司)；DMEM培养基、Ⅱ型胶原酶(GIBCO)；玻璃珠(CUSABIO)；细胞计数器(MARIENFELD公司)；涡旋振荡器(Vortex)；手持式超声波细胞粉碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；小型高速离心机(Eppendorf)；倒置显微镜(OLYMPUS公司)；PI细胞凋亡检测试剂盒、流式细胞仪(BD公司)；CO2培养箱(Termo)；鲁尔接头(ARK)；酶标仪(BIO-RAD)。

1.4实验方法1.4.1基质血管组分细胞的获取实验分为6组，分别为阴性对照、酶解法、普通推注法、改良推注法、玻璃珠法和内置超声波法对脂肪组织进行处理以获得基质血管组分细胞，各组3次生物学重复，其中阴性对照为未经任何处理，阳性对照为酶解法1.4.2酶解法将吸脂手术抽取的脂肪组织放入离心机，2000r/min离心1min，脂肪组织分层，将血水推出，过筛(一层筛网，筛孔尺寸：0.425mm，标准目数：40目)将去除血水后的脂肪组织转移到离心管中，加入等体积的0.2%Ⅱ型胶原酶，来回颠倒混匀，放入37℃培养箱消化60min[28]1.4.3普通推注法将获得的脂肪组织以2000r/min离心1min，将离心后上层油脂回收备用，推出底层血液(最大可能将血液除去)，将中间层高密度脂肪组织用接头转移至1个新的注射器中用手术剪将脂肪组织剪碎，将含有剪碎后的脂肪组织的螺旋纹注射器与1枚新注射器通过1.4mm的鲁尔接头密封对接，然后推动含有高密度脂肪组织的注射器活塞，将脂肪组织从一侧推入另外一侧的注射器中，连续往返推注，推注速度为10mL/s，时间1min将之前油脂加入到经过推注破碎的脂肪组织中，混和均匀最后将上述获得的脂肪组织混合物过滤(2层筛网，40目、60目)[29]。

1.4.4改良推注法其他步骤同普通推注法(见1.4.3)，但将手术剪剪碎改为过筛(一层筛网，筛孔尺寸：0.425mm，标准目数：40目)将吸脂手术抽取的脂肪组织放入离心机，2000r/min离心1min，脂肪组织分层，将血水推出，过筛(一层筛网，筛孔尺寸：0.425mm，标准目数：40目)，2个螺纹注射器(10mL)通过1.4mm孔径的转接头连接，将脂肪组织按照10mL/s、1min的推注速度和推注时间，在2个螺纹注射器间连续来回推注最后将脂肪组织混合物过筛(筛孔尺寸：0.250mm，标准目数：60目)1.4.5玻璃珠破碎法将一定量圆形固态物体(直径为1.0-2.0mm)放入离心管中，高温高压灭菌将吸脂手术抽取的脂肪组织以2000r/min离心1min，将离心后的底层血液弃去，然后过40目筛网，将滤液转移至放有玻璃珠离心管中，再将离心管放置在涡旋振荡仪上，调节转速至2500r/min，振荡9min，振荡产生剪切力进行破碎[30]1.4.6内置式超声波破碎法将吸脂手术抽取的脂肪颗粒放入离心机，2000r/min离心1min，脂肪颗粒分层，将血水推出，超声探头置于去除血水后的脂肪颗粒中，经过反复多次实验最终确定最佳处理功率与时间，以25W的功率对脂肪颗粒处理36s，超声波在脂肪组织中产生空化作用对脂肪细胞进行破碎[31]。

1.4.7基质血管组分细胞的收集(1)酶解法获得的基质血管组分细胞的收集：将在37℃消化60min的脂肪颗粒放入低速离心机，2000r/min离心10min，离心后分3层，上层为油脂或部分未消化完全的脂肪混合物，中间层为完全培养液，下层为基质血管组分细胞沉淀，弃掉上层和中层，加入DMEM完全培养液重悬细胞沉淀，过200目细胞筛，收集滤液，收集到的滤液即为含有高度浓缩的富含脂肪干细胞的基质血管组分细胞[32]2)5种物理方法获得的基质血管组分细胞的收集：将处理后的脂肪颗粒2000r/min离心5min，在油层下的物质即为含有高度浓缩的基质血管组分细胞取500μL移植材料加入500μLDMEM进行混合后2000r/min离心5min，下层的细胞沉淀即为基质血管组分，弃上层物质，向细胞沉淀加入500μLDMEM进行重悬，制成细胞悬液普通推注法在进行上述步骤前应先将过滤后混合物转入密封的注射器中，加上塞子，拉开注射器栓，使注射器内呈现负压，轻轻震荡注射器后再进行离心1.5主要观察指标1.5.1细胞形态学将原始的脂肪颗粒和取得的细胞悬液分别涂布于载玻片上，在倒置显微镜下对成熟的脂肪细胞和基质血管组分细胞的形态及大小进行观察。

1.5.2细胞存活率向90μL细胞悬液中加入10μL0.4%锥虫蓝，吹打混匀后加入细胞计数器，在倒置显微镜下进行计数，染上蓝色的细胞即为死细胞，无色的即为活细胞计数方法：分别计数5个中方格的总细胞数，然后求得每个中方格的平均值，再乘以16×104，即为总细胞数以相同的方法计算活细胞数，活细胞数除以总细胞数即为细胞的存活率[33,34]1.5.3细胞增殖率首先将各个样品稀释至相同细胞浓度(1×108L-1)，然后在96孔板中用DMEM/F12(含体积分数为2%胎牛血清)配置100μL细胞悬液将96孔板在培养箱预培养48h(在37℃，体积分数为5%CO2条件下)，每孔加入10μLCCK-8溶液，在培养箱内孵育1-4h，用酶标仪测定450nm处的吸光度值1.5.4细胞活性将各个样品稀释至相同细胞浓度(约1×108L-1)，以每孔100μL接种至96孔板，第1个孔为无细胞的DMEM培养液(背景空白对照孔)，之后为不同实验样品的细胞孔(样品孔)，加入LDH释放试剂，加入量为原有细胞悬液体积的10%，反复吹打混匀，然后在细胞培养箱中孵育1h，最后每孔加入60μLLDH工作液，混匀，室温避光孵育30min(可用铝箔包裹后置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动)，酶标仪测定450nm处吸光度值。

1.5.5细胞碎片及凋亡率将上述制得的细胞悬液2000r/min离心5min，收集沉淀；用PBS漂洗细胞2次，并进行细胞计数，1500r/min离心5min，收集细胞(1×108L-1)；加入500μLPBS重悬细胞沉淀；加入5μLPropidiumIodide混匀，室温避光反应10min;1200r/min离心5min,500μLPBS重悬细胞沉淀，重复2次：最后用流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞碎片率[35,36]1.6统计学分析采用SPSS22.0统计软件进行数据分析，所有数据均用表示，采用单因素方差分析用于多组间或两两比较，P<0.05为差异有显著性意义2、结果2.1细胞形态学将脂肪颗粒直接涂布后在倒置显微镜下进行观察，成熟的脂肪细胞以单个或成群的形式存在于人体内，其体积与大部分细胞相比较大，有50-150μL，其大小与人体的肥胖程度呈正相关，一般为圆形或与周围细胞挤压后呈多边形，见图1，细胞中央有一大滴脂滴，胞质呈薄层，位于细胞周缘，包绕脂滴，核扁，被挤压至边缘图1人成熟脂肪细胞的形态图注：图中A为人体成熟脂肪细胞(×10);B为人体成熟脂肪细胞(×40)将用完全培养液重悬的含有基质血管组分细胞的细胞悬液进行涂。