总黄酮的测定方法.doc

总黄酮的测定方法黄酮类化合物是广泛存在于植物界的一大类天然产物,种类繁多, 大多数黄酮类化合物与葡萄糖或鼠李糖结合成苷,部分为游离态或与鞣质结合存在黄酮化合物系色原烷或色原酮的2-或 3-苯基衍生物, 一般具有 C6-C3-C6 的基本骨架结构近年来, 黄酮类化合物以其广谱的药理作用倍受青睐, 人们对含有黄酮的化合物进行大量研究, 以期获得黄酮含量较高的中草药因此黄酮的含量测定成为研究的关键步骤一、方法（一）高效液相色谱法 1. 原理 植物类样品用石油醚脱脂后，经甲醇加热回流提取，以高效液相色谱法分离，在紫外检测器 360nm 条件下，以保留时间定性、峰面积定量2．仪器和试剂 （1）高效液相色谱仪 （2）紫外检测器 （3）层析柱 （4）超声波清洗仪（5）索氏提取器 （6）微孔过滤器（滤膜 0.45um） （7）甲醇（色谱纯） （8）芦丁标准品 （9）石油醚，盐酸，磷酸（分析纯） （10）去离子水 （11）芦丁标准溶液：精确称取经 105℃干燥恒重的芦丁标谁品 15.0mg，加甲醇溶解并定容至 100ml，配成 150ug／ml 的芦丁标准溶液3. 操作步骤（1）样品处理 1）固体样品：称取 2.0g 干燥的固体样品，研细，置于索氏提取器中，用石油醚（60～90℃）提取脂肪等脂溶性成分，弃去石油醚提取液，剩余物挥去石油醚，加人甲醇50ml 和 25％HC1 5ml，80℃水浴回流水解 1h，取出后快速冷却至室温，转移至 50ml 容量瓶中，甲醇定容，经 0.45um 滤膜过滤，供分析用。

2）液体样品：准确吸取样品 2.0ml，直接以石油醚萃取脱脂，挥去石油醚后，以甲醇溶解并定容，经微孔滤膜（0.45um ）滤过后供测定用 （2）色谱分离条件 色谱柱：CLC － ODS，6mm× 150mm，5um; 流动相：0.3％磷酸水溶液：甲醇（V:V ）＝40:80，临用前用超声波脱气； 流 速：lml／ min； 柱 温：40℃； 检测波长：360nm ； 灵敏度：0.02AUFS； 进样量：20ul （3）样品测定：准确吸取样品处理液和标准液各 10ul，注入高液相色谱仪进行分离，以其标准溶液峰的保留时间定性，以其峰面积计算出样品中总黄酮的含量4、结果计算（二）分光光度法1．原理 黄酮类化合物是具有苯并吡喃环结构的一类天然化合物的总称，一般都具有 4 位羰基，且呈现黄色黄酮类化合物的 3—羟基、4—羟基或 5—羟基、4－羰基或邻二位酚羟基，与铝盐进行络合反应，在碱性条件下生成红色的络合物 本方法对样品中黄酮类化合物进行提取纯化后，用分光光度法于 510nm 波长下测定其吸光度，与芦丁标准品比较，进行待测物中总黄酮的定量测定2．仪器和试剂 （1）722 分光光度计 （2）索氏提取器 （3）真空泵，盐基交换管等。

（4）恒温水浴，分液漏斗 （5）芦丁标准品 （6）亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠（分析纯） （7）氯仿，无水乙醇，甲醇（分析纯） 8）5％香草醛溶液：称取 5g 香草醛，加冰乙酸溶解并定容至 100ml （9）聚酰胺树脂（10）去离子水3．操作步骤 （1）样品处理 1）固体样品：称取 1～2g 干燥的固体样品，用滤纸包紧，置于索氏提取器中，加入50～100ml 70％乙醇溶液浸润后，在 80℃水浴下回流 3h，至提取液无色为止粗提液冷却后，减压抽滤，并用少量 25％乙醇溶液洗涤滤渣，合并滤液在 50℃下减压蒸馏，除去其中的乙醇，直至索氏提取器内溶液呈无醇味倒出容器内溶液，用 30ml 热水分 3 次洗涤，抽滤后，将滤液倒入分液漏斗中，以 75ml 氯仿分 3 次萃取脱脂，待完全分层后，收集各次下层水溶液并定容至 50ml 称取 1～2g 经预处理的聚酰胺树脂粉末，湿法装柱，用水饱和吸取上述脱脂后的水溶液1～2ml，沿层析柱漫漫滴人柱内，放置一定时间，待测液被充分吸附后，用 70％乙醇或甲醇洗脱，流速为 1.0ml／min，至流出液基本无色，一般收集 10ml 即可上述洗出液用洗脱剂定容后即可用于测定。

2）液体样品：准确吸取 1.0ml 样品，定容至 50ml 后，直接以 75ml 氯仿分 3 次萃取脱脂，其余步骤同上 （2）标准曲线的绘制：准确吸取芦丁标准溶液 0、0.50、1.00、2.00、3.00、⒋00ml （相当于芦丁 0、75、150、300、450、600ug） ，移入 10ml 刻度比色管中，加入 30％乙醇溶液至5ml，各加 5％亚硝酸钠溶液 0.3ml，振摇后放置 5min，加入 10％硝酸铝溶液 0.3ml 摇匀后放置 6min，加 1.0mol／L 氢氧化钠溶液 2ml，用 30％乙醇定容至刻度摇匀，放置15min，于 510nm 波长处测定吸光度，以零管为空白，以芦丁含量（ug）为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线，计算相关系数（r） （3）样品测定：根据样品中总黄酮含量高低，取适宜体积待测液，按标准曲线制备操作步骤于 510nm 处进行吸光度的测定（样液如有沉淀，应过滤后测定） 4.结果计算 根据标准工作曲线，求出相当于样品吸光度的芦丁含量，按下式求出总黄酮含量（三）毛细管电泳法毛细管电泳法是离子或荷电粒子以电场为驱动力, 在毛细管中按其淌度或分配系数不同进行高效、快速的电泳分离新技术。

常用的方法主要有毛细管区带电泳( CZE )、胶束电动力学毛细管色谱(MEKC) 、毛细管凝胶电泳( CGE) 、毛细管等速电泳( CITP) 等它的各种操作模式特别是 CZE 和 MEKC 都能很好的用于中药成分含量分析四）其他共振散射光谱法、单扫示波极谱法、近红外漫反射光谱法（对已知总黄酮含量的样品在1100 ~2500 nm 处扫描建立样本数据库 , 对预测集样品进行分析 , 结果预测值与 H PLC 真值的相关系数( r )为 0. 973, 结果准确且提高了检测效率） 、流动注射法-化学发光, 电化学法, 免疫化学发光, 这些检测灵敏度高的分析方法也将逐步应用于总黄酮的含量测定二、总黄酮的作用1、对造血系统的保护作用2、对免疫系统的保护作用3、清除自由基、抗氧化作用4、保护 DNA三、为什么测植物中总黄酮的含量多用芦丁做对照品？1 芦丁有典型的黄酮类结构和紫外特征，在总黄酮家族中是比较典型的代表物质2 芦丁在很多含有黄酮类物质的植物中广泛存在，而且含量比较高3 芦丁比较容易分离得到纯体，作为对照品比较易得四、芦丁标准溶液的配制 称量13.2mg芦丁，用60%乙醇定容到25ml容量瓶作为标准溶液。

备注：如有不恰当的地方，请老师尽管指点。