新型鸭病毒性肝炎病毒.ppt

1.1 DHV的历史与分布,鸭肝炎病毒(DHV)包括三个血清型，分别引起Ⅰ型, Ⅱ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎其中Ⅰ型鸭病毒性肝炎呈世界性分布我国流行的鸭病毒性肝炎主要为Ⅰ型鸭病毒性肝炎，近年来陆续有新型鸭病毒性肝炎发现三个型之间无抗原相关性，没有交叉保护和交叉中和作用DHV最早发现是在1945年由Levine在美国发现了Ⅰ型鸭病毒性肝炎该病呈世界性分布，曾在加拿大、意大利、法国、日本、美国和埃及等地流行、在我国广东、北京、浙江、福建、四川、安徽、广西、江苏、山东等地相继发生该病、目前几乎世界范围内主要养鸭地区均存在该病，给养鸭业带来了巨大的经济损失Ⅱ型鸭病毒性肝炎是1958年首先爆发于英格兰诺福克鸭场，其他地区未见本病的报道Ⅲ型鸭病毒性肝炎是1969年首次发现于美国纽约长岛地区1999年，苏敬良等和黄安国等在北京和广西等地在3～13日龄疑似鸭肝炎的北京鸭和樱桃谷鸭上分离到两株与I型和III型DHV无血清学交叉免疫反应的DHV，认为出现了新的血清型，并将其命名为新型鸭肝炎病毒新型鸭病毒性肝炎的基因组与I型结构相似，但比I型DHV基因组稍大同时，发现高变区主要存在于VP1和VP3基因、在VP1,VP3基因上存在多个T细胞抗原表位和B细胞抗原表位，VP1基因的变异致使不同血清型DHV抗原性发生改变。

1.2 DHV的生物学特征,2006年Kim M C报道了I型DHV的全基因组序列，2007年Tseng C H报道了DHV-1型变异株全基因组序列，为DHV的研究做出了新的突破DHV与其他小RNA病毒相比，DHV基因组具有一些特殊的结构特征,TsengC H等建议将I型DHV归为小RNA病毒科一个新的独立的属T.Yun等构建出了具有感染性的DHV全长cDNA克隆，为进一步揭示DHV基因组的结构和功能及防控该病提供了良好的技术平台I型DHV基因组大小约为7,690nt,编码2,249aa、具有一个较大的开放阅读框(ORF)，在基因组RNA两端各有一段保守的非编码区,I型DHV全基因组结构依次为:5'UTR(626nt)-VPO-VP3-VPl-2A1-2A2-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3'UTR (314nt),5'UTR内含有病毒翻译起始所必需的内部核糖体进入位点(IRES),,I型DHV的IRES己报道具有8个茎环结构，3’UTR内含有病毒RNA复制和翻译有关的poly(A)尾I型DHV的3’UTR为314 nt，新型DHV的3’UTR为366 nt，均具有典型的小RNA病毒的基因组结构、,I型DHV多聚蛋白具有11个切割位点，且具有与小RNA病毒相似的切割位点和保守基因序列。

基因组编码区包含结构蛋白和非结构蛋白，分为3种初级前体分子P1,P2,P3,其中，P1前体蛋白裂解为组成病毒衣壳蛋白VP0,VP3和VP1，3种结构蛋白P2和P3构成病毒的非结构蛋白P2编码2A1,2A2,2A3,2B和2C 3种非结构蛋白，P3编码3A,3B,3C和3D 4种非结构蛋白2.1 非编码区,I型DHV基因组5‘UTR长626 nt ,内含病毒翻译起始所必需的内部核糖体进入位点(IRES)在各病毒属不同血清型之间，小RNA病毒IRES元件的序列和二级结构具有保守性，是病毒存活所必需的小RNA病毒的IRES分为3个型，I型IRES的病毒包括肠道病毒属和鼻病毒属，心脏病毒属、口疮病毒属，双埃柯病毒属的IRES属于II型IRES;甲肝病毒属的IRES属于III型IRES通过对I型DHV的RNA级结构预测表明，I型DHV的5’UTR可能含有II型IRES的颈环结构而没有I型的三叶草结构，,,据此推断I型DHV的5’UTR区域会形成II型的IRES I型DHV的3’UTR长为314-317nt，新型DHV长366nt，这在小RNA病毒基因组中是最长的有学者报道,I型DHV的3’UTR形成了5个发夹结构，参与病毒的复制，但它是否与宿主特异性有关还需进一步研究。

病毒的3’端poly(A)尾作为病毒RNA的负链合成起始位点，其长度与负链RNA的合成效率及病毒RNA的感染能力有关2.2 编码区,DHV包含一个大的ORF，编码一个多聚蛋白，多聚蛋白在翻译过程中不断被自身编码的蛋白酶水解，从而分解成P1、P2和P3产物，P1、P2和P3又进一步分别分解为VP0 -VP3 -VP1-2A1-2A2-2B-2C-3A-3B-3C-3D、I型DHV的多聚蛋白的切割位点预测的结果是:VP0/VP3和3C/3D的切割位点为：Q/G;2A3/2B,2B/2C ,2C/3A,3A/ 3B以及3B/ 3C的切割位点为Q/S；VP3/VP1的切割位点为Q/M多聚蛋白水解产生的多肤数量主要由以下因素决定: (1)基因组是否存在L蛋白 (2)VP0是否水解为VP4和VP2 (3)2A蛋白的数量其也是小RNA病毒的基因组在 不同的种属之间存在的差异所在小RNA病毒的基因组在不同的种属间虽然存在差异，但是在病毒复制过程中具有相似的功能、,L蛋白作为前导蛋白;2A是蛋白酶，参与多聚蛋白早期切割和宿主蛋白的合成关闭;2B蛋白作为宿主范围的决定因子;2C蛋白是小RNA病毒中的保守序列，与病毒RNA合成相关;3A蛋白与病毒毒力有关;3B蛋白即VPg，是共价结合于正链和负链RNA 5’末端的蛋白引物;3C蛋白构成大部分多聚蛋白，3C蛋白在病毒加工处理过程和RNA复制中产生，具有水解多聚蛋白活性，并且具有一个半胱氨酸作为亲核作用的活性位点.3D蛋白是RNA依赖的RNA聚合酶。

2.2.1结构蛋白: P1区编码病毒的壳体蛋白，包括VP0,VP3,VP1基因，核苷酸序列全长2193 nt、 I型DHV VP0的N末端缺少GxxxS/T基因序列，因此其N末端可能未被十四烷基化，VP0不被蛋白酶切割为VP2和VP4试验证明，壳体蛋白含有多个类似于其他小RNA病毒的核心结构，即八链反向平行β桶结构，与其相连的环形结构位于壳粒表面，这在免疫学中占有重要作用I型DHV的VP3与人肠道病毒(Humanparechovirus, HPeV)一样，N一末端有一段残基丰富区延伸出来，长度约20aa,这段区域在HPeV中具有很强的免疫原性但它在I型DHV是否也具有同样的功能还未见报道1)VPl基因: 小RNA病毒中VP1蛋白作为主要的宿主保护蛋白，具有特异性抗原中和位点，VP1蛋白多暴露于病毒表面，是决定病毒抗原性的主要成分，它能够诱导动物产生中和抗体I型DHV与其他小RNA病毒之间衣壳蛋白的氨基酸序列差异主要存在于VP1的两端何内娅通过对华南地区分离到的I型和新型DHV的VP1氨基酸序列比对分析表明:VP1包括了大部分的插入与缺失片段和高变异区，高变区主要分布在46 -64,95-149,180-223位，尤其是C末端，存在点突变或连续变异。

在第145-146位，15株新型DHV毒株比3株I型DHV多2个氨基酸(G和G)I型DHV和新型DHV的VP1蛋白不存在小RNA病毒科保守的RG D基序((Arg-Gly-Asp(RGD)) ,而I型DHV相应序列为SGD，而新型DHV为QSD，这表明DHV的病毒吸机制和复制能力存在差异还有待于进一研究2)VP3基因: VP3蛋白的N末端具有免疫原性，VP3的N端以及连接β链的环，特别是βB-C,βE-F及βG-H环的序列差异显著、何内娅通过对华南地区分离到的I型和新型DHV与参考毒株进行VP3基因的变异分析，结果显示，I型DHV和新型DHV的VP3基因不同点在于:第三位I型(R) →新型(K)，第15位I型(N) →新型(S)(除了台湾新型)，第20位I型(P)→新型(S)，第22位I型(V) →新型(I)，第39,40位I型(IA) →新型(VT)，第45、69位I型(T,I) →新型(A/V , V)，第78位～第107位为I型和新型DHV变异最多处，第125,126位I型(MT) →新型(LL)，第143到第234位I型和新型DHV存在不连续的多位点不同，这些变异区是否影响I型和新型DHV的致病机理有待于进一步研究。

2.2.2非结构蛋白: (1)P2非结构蛋白: 小RNA病毒中，P2区长2271nt,I型DHV推测具有多达3种不同的2A蛋白，分别是2A1 ,2A2和2A3以及2B,2CDHV的2A2蛋白是小RNA病毒多聚蛋白中的1个新蛋白，由161aa组成，可能参与病毒与宿主细胞之间相互作用，推测与病毒复制有关2A3蛋白由124aa组成，含有3个结构域2A3蛋白可能在控制细胞生长方面起作用，目前关于小RNA病毒2B和2C蛋白的具体功能还不清楚2)P3非结构蛋白: P3区编码4种非结构蛋白，分别是3A ,3B ,3C和3D据报道，小RNA病毒科的病毒,3A蛋白与病毒毒力有关3BVPg蛋白包含34个as，这在小RNA病毒中是最大的3B蛋白，并且与其他小RNA病毒的3B蛋白序列一致性很低，DHV的L(亮氨酸)被小RNA病毒KP基序中的K(赖氨酸)所取代，但是该蛋白第3位酪氨酸Tyr (Y)残基却很保守，它在VPg与基因组5’末端尿嘧啶的附着过程中起重要作用DHV的3C蛋白酶是催化裂解小RNA病毒多聚蛋白中非结构蛋白部分的关键酶，具有丝氨酸蛋白酶和半肤氨酸蛋白酶双重特性，病毒编码的3C蛋白酶完成多聚蛋白的大多数切割，通常发生在谷氨酞胺和甘氨酸之间的肤键( Gln-Gly ) ,最终产生11个终末产物。

DHV的3D蛋白是依赖RNA的RNA聚合酶( RNA-dependent RNA polymerase),3D蛋白在病毒RNA复制中起主导转录及复制作用2.新型鸭病毒性肝炎病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及应用,近年来，DVH在世界各地不断发生，其发病率和死亡率均呈上升趋势，养鸭比较集中的地区均遭受了巨大的经济损失和严重的威胁，由于新型鸭病毒性肝炎病毒(N-DHV)的存在，许多地区频频出现I型鸭病毒性肝炎病毒(DHV- I)免疫鸭群暴发鸭肝炎的报道，严重制约了养鸭业的发展，不少学者己从发病鸭群中分离到工型鸭肝炎病毒的变异株(新型毒株,N-DHV),2007年，有学者先后证实新型DHV也具有典型的DHV I基因组结构，但其与DHV -I在序列上存在显著差异，且新型DHV均不与DHV- I产生交叉反应因此，加强N-DHV病原诊断技术的研究对预防和控制鸭病毒性肝炎具有重要的现实意义本试验选取新型DHV与传统工型DHV差异序列区设计引物，建立了N-DHV检测的逆转录巢式PCR方法，旨在为新型鸭病毒性肝炎的早期诊断、流行病学调查等提供一种有效的分子生物学检测方法2.1 材料和方法,2. 1.1 病毒 N-DHV、DHV-Ⅰ、鸭病毒性肠炎病毒(DEV)、鸭细小病毒(DPV)、新城疫病毒(NDV )、传染性法氏囊病毒(IBDV)均由本实验室分离并保存。

2.1.2主要试剂 Trizol、M-MLV反转录酶、Ribonuclease Inhibitor购自生工生物工程(上海)有限公司;Ex Taq酶、pMD18-T克隆载体及其他限制性内切酶均购自宝生物工程(大连)有限公司;质粒DNA提取试剂盒与胶回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司2.1.3引物的设计与合成 根据己发表的N-DHV基因组序列，选取N-DHV与DHV- I差异序列区设计引物，利用生物学软件设计合成了2对引物，引物序列如下: 第1轮扩增引物: 上游引物:ygpl 5'-TUTUCCTUAUAAUCUUUATA-3'; 下游引物:ygp2 5'-CCUAAAUTUUAUATTAUUTG3‘; 第2轮扩增引物: 上游引物:ygp3 5'-CAUCCACAUCCAUCUACAACr3'; 下游引物:ygp4 5'-TTUCTCTUCUUTATCCTUCC-3' 2.1.4病毒基因组RNA的提取 按Trizol试剂使用说明提取N-DHV基因组RNA，并提取其他几种病毒的DNA或RN。