第三章蛋白质的化学.ppt

Chapter 3 Structure and Function of Protein内容简介w蛋白质的分类及生理学功能w氨基酸的结构和性质w肽的结构和生理功能w蛋白质的多级结构和性质w蛋白质的研究技术第一节 蛋白质的分类及生理学功能w蛋白质蛋白质(protein) 是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物1.1 1.1 蛋白质的化学组成蛋白质的化学组成蛋白质的元素组成蛋白质的元素组成元素元素CHONS其它其它PFeI2含量％含量％53723161酪蛋酪蛋白白血红血红蛋白蛋白甲状腺甲状腺球蛋白球蛋白蛋白质含量（克％）蛋白质含量（克％）= =每克生物样品中含氮的克数每克生物样品中含氮的克数   6.256.25w三聚氰胺性状为纯白色单斜棱晶体，无味，在水中溶解度随温度升高而增大,在20℃时，约为3.3 g/Lw三聚氰胺的含氮量为66％左右因此，添加三聚氰胺会使得食品的蛋白质测试含量虚高 w三聚氰胺进入人体后，发生取代反应(水解)，生成三聚氰酸，三聚氰酸和三聚氰胺形成大的网状结构，造成结石1.2 1.2 蛋白质的分类蛋白质的分类1 1、根据分子形状、根据分子形状2 2、根据蛋白质组成：、根据蛋白质组成：ü简单蛋白质：简单蛋白质：水解为水解为 α-α-氨基酸氨基酸＆结合蛋白质：结合蛋白质：单纯蛋白质单纯蛋白质+ +辅基，如色蛋白、辅基，如色蛋白、糖蛋白、磷蛋白、核蛋白、脂蛋白等。

糖蛋白、磷蛋白、核蛋白、脂蛋白等3 3、根据蛋白质溶解度：、根据蛋白质溶解度：4 4、根据蛋白质功能、根据蛋白质功能ü 活性蛋白质（识别）活性蛋白质（识别）ü 非活性蛋白质（保护）非活性蛋白质（保护）1.3 蛋白的生理功能1． 酶 2．结构成分（结缔组织的胶原蛋白、血管和皮肤的弹性蛋白、膜蛋白）3．贮藏（卵清蛋白、种子蛋白）4．物质运输（血红蛋白、Na+-K+-ATPase、葡萄糖运输载体、脂蛋白、电子传递体）5．运动（肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白）6．激素功能（胰岛素）7．抗体(免疫信号）8．接受、传递信息（受体蛋白，味觉蛋白）9．调节、控制细胞生长、分化、和遗传信息的表达（组蛋白、阻遏蛋白）1． 酶2．结构成分3．贮藏4．物质运输5．运动6．激素功能7．抗体8．接受、传递信息甜味受体由T1R2 和T1R3组成，鲜味受体T1R1 和T1R3 9．调节、控制细胞生长第二节　氨基酸的结构和性质w氨基酸的结构w氨基酸的分类w氨基酸的物理性质w氨基酸的化学性质不变部分不变部分可变部分可变部分手性手性 - -碳原子碳原子2.1 2.1 氨基酸的结构氨基酸的结构 - -氨基酸的结构通式氨基酸的结构通式COOHCHH2NR氨基酸的立体异构体（（1 1）常见的天然氨基酸）常见的天然氨基酸（（2 2）不常见的稀有氨基酸－－）不常见的稀有氨基酸－－是正常氨基酸的衍生物，在遗传上没有直接的三联密码。

3 3）非蛋白质氨基酸－－）非蛋白质氨基酸－－不在蛋白质分子中出现的氨基酸2.2 2.2 氨基酸的分类氨基酸的分类苏氨酸苏氨酸半胱氨酸半胱氨酸甘氨酸甘氨酸丙氨酸丙氨酸缬氨酸缬氨酸丝氨酸丝氨酸脯氨酸脯氨酸亮亮氨氨酸酸异异亮亮氨氨酸酸甲甲硫硫氨氨酸酸（（1 1）常见的天然氨基酸）常见的天然氨基酸苯丙氨酸苯丙氨酸酪氨酸酪氨酸色氨酸色氨酸组氨酸组氨酸 赖赖氨氨酸酸 精精氨氨酸酸天冬氨酸天冬氨酸 谷谷氨氨酸酸 天冬酰胺天冬酰胺 谷谷氨氨酰酰胺胺 20种氨基酸的名称及缩写代号Gly,Ala,Val,Leu,Ile,Phe, Trp , Pro,Met 带电荷带电荷Ser,Thr, Tyr, Cys ,Asn,Gln带正电带正电: His,Lys,Arg带负电荷带负电荷:Asp,GLu不带荷不带荷: :极极性性氨氨基基酸酸氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸非非极极性性氨氨基基酸酸常见的天然氨基酸分类常见的天然氨基酸分类 也称修饰氨基酸，是在蛋白质合成后，由基本氨基酸 修饰而来 (1) 4-羟脯氨酸 (2) 5-羟赖氨酸 这两种氨基酸主要存在于结缔组织的纤维状蛋白中。

(3) 6-N-甲基赖氨酸（存在于肌球蛋白中）   (4) г-羧基谷氨酸：存在于凝血酶原及某些具有结合 Ca2+离子功能的蛋白质中  (5) Tyr的衍生物： 3.5 -二碘酪氨酸、甲状腺素 （甲状腺蛋白中） (6) 锁链素由4个Lys组成（弹性蛋白中） (2)(2)非编码的蛋白质氨基酸非编码的蛋白质氨基酸不组成蛋白质，但有生理功能（1）L-型α –氨基酸的衍生物      L-瓜氨酸、L-鸟氨酸是尿素循环的中间物（2）D-型氨基酸      D-Glu、D-Ala（肽聚糖中）、D-Phe（短杆菌肽S）（3）β-、γ-、δ-氨基酸   β-Ala（泛素的前体）、γ-氨基丁酸（神经递质） (3)(3)非蛋白质氨基酸非蛋白质氨基酸2.3 2.3 氨基酸的一般物理性质氨基酸的一般物理性质（（1 1）无色晶体，熔点极高，一般在）无色晶体，熔点极高，一般在200℃200℃以上以上（（2 2）不同氨基酸有不同的味感）不同氨基酸有不同的味感（（3 3）能溶于稀酸或稀碱，不溶于有机溶剂）能溶于稀酸或稀碱，不溶于有机溶剂( (酸性的酸性的－－COOHCOOH基和碱性的基和碱性的－－NHNH2 2基，为两性电解质基，为两性电解质) )（（4 4）极性）极性（（5 5）具有旋光性）具有旋光性 如果如果R≠H，则具有，则具有不对称碳原子不对称碳原子，，因而氨基酸大多是光活性物质因而氨基酸大多是光活性物质(Gly除外除外R为为H原原子无手性碳原子子无手性碳原子)天然氨基酸除天然氨基酸除脯氨酸和甘氨酸脯氨酸和甘氨酸外，其余属于外，其余属于L-α-L-α-氨基酸氨基酸。

 色色氨氨酸酸、、酪酪氨氨酸酸和和苯苯丙丙氨氨 酸酸 对对 紫紫 外外 光光 有有 光光 吸吸 收收 其其吸吸收收峰峰在在 2 28 80 0n nm m 左左右右，，以以色色氨氨酸酸吸吸收收最最强强氨基酸的紫外吸收光谱氨基酸的紫外吸收光谱（（6）紫外吸收性质）紫外吸收性质可用于蛋白定量检测（（7）两性解离及等电点）两性解离及等电点pK1pK1pK2pK2Ø给定的pH下，可根据Henderson-Hasselbalch方程确定出占优势的电离态pH=pK+lg([质子受体] / [质子供体]) pH≻pK [HA]‹[A-] (质子供体浓度小于质子受体浓度） 解离基团主要以共轭碱的形式存在解离基团主要以共轭碱的形式存在 pH ‹pK [HA] ≻[A-] (质子供体浓度大于质子受体浓度） 解离基团主要以共轭酸的形式存在解离基团主要以共轭酸的形式存在甘氨酸的解离曲线甘氨酸的解离曲线起点：100% Gly+  净电荷：+1第一拐点：50%Gly + ，50%Gly±   平均净电荷：+0.5 pH=pK1+lg[Gly±]/[Gly+](羧基解离)       (pK1  = 2.34)       对于氨基来说，pH《pK2,因此只有供体形式，即带正电状态NH3+第二拐点：100%Gly±       净电荷：  0    等电点pI第三拐点：50%Gly±，  50%Gly-   平均净电荷：-0.5    pH=pK2+lg[Gly]/[Gly±](氨基解离)         (pK2=9.6)         对于羧基来说，pH》pK1,因此只有质子受体形式，COO-终点： 100% Gly-   净电荷：-1等电点偏酸在于羧基解离度大于氨基解离度 看成多元酸的滴定，看成多元酸的滴定，突跃点（拐点）即缓突跃点（拐点）即缓冲能力最强的点，所冲能力最强的点，所量量pHpH值即值即pKpK值值在适当的酸碱度时，氨基酸溶液中在适当的酸碱度时，氨基酸溶液中-NH3+和和COO-解离度完全相同，此时正离子和负离子浓解离度完全相同，此时正离子和负离子浓度相同，度相同，净电荷为零净电荷为零；在电场中既不向阳极移动；在电场中既不向阳极移动也不向阴极移动，成为也不向阴极移动，成为两性离子两性离子（或兼性离子），（或兼性离子），这时氨基酸所处这时氨基酸所处溶液中的溶液中的pH值值就是该氨基酸的就是该氨基酸的等电点（等电点（pI）。

等电点（等电点（pI）时溶解度最小时溶解度最小等离子点等离子点VS 等电点等电点（等电点受离子浓度干扰）（等电点受离子浓度干扰）等电点的概念等电点的概念等电点的推导等电点的推导[Ala+]=[Ala±][H+]K1移项：移项：[Ala-]=[Ala±] K2[H+]根据等电点的定义根据等电点的定义:[Ala+]= [Ala-][Ala±][H+]K1[Ala±] K2[H+]=整理：K1 K2 [Ala±]= [Ala±] [H+] [H+]K1 K2= [H+]2两端取对数：-lg [H+]2 =-lg K1-lg K2∵-lg K1 = pk1     -lg K2= pk2 ∴2 （-lg [H+]）= pk1+pk2 根据pH 的定义得：pH=lg 1/ [H+] =-lg [H+]∴ 2 pH=pk1+pk2pI=1/2( pk1+pk2 )♣中性氨基酸：中性氨基酸：pIpI = (pK = (pK1 1 + pK + pK2 2 )/2 )/2 ♣酸性氨基酸：酸性氨基酸：pIpI = (pK = (pK1 1 + + pKpKR R-COO-COO- - )/2 )/2 ♣碱性氨基酸：碱性氨基酸：pIpI = (pK = (pK2 2 + pK + pKR-NHR-NH2 2 )/2 )/2 ► pK pK1 1指指α-α-羧基离解常数的负对数值；羧基离解常数的负对数值；► pKpK2 2指指α-α-氨基离解常数的负对数值；氨基离解常数的负对数值；►pKpKR R指侧链指侧链R R基离解常数的负对数值。

基离解常数的负对数值氨基酸等电点计算w对谷氨酸：A+     Ao      A-       A2-2.194.259.67pI＝（2.19+4.25）/2＝3.22对赖氨酸：A2+      A+      Ao      A-2.188.9510.53pI＝（8.95+10.53）/2＝9.74 如果有多个功能基团，逐步如果有多个功能基团，逐步解离质子，则等电点为带一解离质子，则等电点为带一负电形式和带一正电形式两负电形式和带一正电形式两旁旁pKpK值的平均值值的平均值（（1 1）与亚硝酸的反应）与亚硝酸的反应( (氧化还原性）氧化还原性）（（2 2）成盐作用（）成盐作用（HCl，碱性），碱性）（（3 3）与甲醛的反应（亲核性））与甲醛的反应（亲核性）（（4 4）酰基化与烃基化反应（亲核性））酰基化与烃基化反应（亲核性）（（5 5）脱氨反应（氨基酸的代谢）脱氨反应（氨基酸的代谢, ,酶催化）酶催化）2.4 2.4 氨基酸的化学通性氨基酸的化学通性（一）由氨基参加的反应（一）由氨基参加的反应氨基酸氨基同其它伯氨一样，室温下与亚硝酸作用生成氨基酸氨基同其它伯氨一样，室温下与亚硝酸作用生成氮气氮气AA + AA + 亚硝酸亚硝酸 →→  - -羟基酸羟基酸 + + 氮气氮气↑↑+ + 水水用途：范斯莱克氨基氮测定法，用于氨基酸用途：范斯莱克氨基氮测定法，用于氨基酸 定量和测定量和测蛋白质水解进行程度蛋白质水解进行程度( (氮气一半来自氨基酸，一半来自氮气一半来自氨基酸，一半来自亚硝酸）亚硝酸）生产上用来测定氨基酸含量和蛋白质水解程度。

因为蛋生产上用来测定氨基酸含量和蛋白质水解程度因为蛋白质总氮量（凯氏定氮）不变，亚硝酸法测定的氨基氮白质总氮量（凯氏定氮）不变，亚硝酸法测定的氨基氮却在不断上升，用氮气量的一半除以总氮量，可以表示却在不断上升，用氮气量的一半除以总氮量，可以表示蛋白质的水解程度蛋白质的水解程度1 1）与亚硝酸反应）与亚硝酸反应用途用途：由于氨基为弱酸，不容易滴定定量（弱酸或物质浓度低，滴定突跃范围小都很难找到指示剂在其范围内），通过甲醛衍生，是其变为较强酸，滴定终点范围可用酚酞标示）羟甲基氨基酸二羟甲基氨基酸（（2 2）甲醛反应：）甲醛反应：AA + AA + 甲醛甲醛 → → 二羟甲基氨基酸二羟甲基氨基酸Ø用途用途：N末端氨基酸测定末端氨基酸测定AAAA与丹磺酰氯的反应与丹磺酰氯的反应（3）酰基化与烃基化反应（荧光）（荧光）w荧光性质，使检测灵敏度可以达到荧光性质，使检测灵敏度可以达到1 1 1010-9-9molmolØ用途用途： SangerSangerSangerSanger反应，反应，反应，反应，N N N N末端氨基酸测定末端氨基酸测定末端氨基酸测定末端氨基酸测定AAAA与二硝基氟苯（与二硝基氟苯（DNFBDNFB）的反应）的反应（黄色）（黄色）实际上也是一种实际上也是一种N-N-端分析法。

此法能够不断重复端分析法此法能够不断重复循环，将肽链循环，将肽链N-N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离端氨基酸残基逐一进行标记和解离PTH-AAEdmanEdman （（苯异硫氰酸酯法苯异硫氰酸酯法））- -氨基酸顺序分析法氨基酸顺序分析法（（1 1）成酯和成盐反应（）成酯和成盐反应（+ + 醇）醇）（（2 2）成酰胺反应（）成酰胺反应（AsnAsn，，GlnGln））（（3 3）酰氯化反应（酰化氨基酸））酰氯化反应（酰化氨基酸）（（4 4）叠氮反应）叠氮反应（（5 5）脱羧反应（）脱羧反应（+ + 酶酶) )（二）由羧基参加的反应（二）由羧基参加的反应　a.AA + NaOH －→ 氨基酸钠盐(氨基酸的碱金属盐能溶于水,重金属盐不溶于水)　b. 　　　　　HCl　AA + EtOH －→ 氨基酸乙酯的盐酸盐 成成盐盐成成酯酯反反应应屏蔽羧基化学反应性的方法屏蔽羧基化学反应性的方法形形形形成成成成酰酰酰酰卤卤卤卤的的的的反反反反应应应应用途用途：这是使氨基酸羧基活化的一个重要反应这是使氨基酸羧基活化的一个重要反应保护基简写（胺基酰化）保护基简写（胺基酰化）酰化胺基酰化胺基叠叠叠叠氮氮氮氮化化化化反反反反应应应应用途用途：常作为多肽合成活性中间体，常作为多肽合成活性中间体，活化羧基。

活化羧基经过酰化、酯化经过酰化、酯化变成酰化氨基酸变成酰化氨基酸甲酯，再与联氨甲酯，再与联氨和亚硝酸作用，和亚硝酸作用，生成叠氮化合物生成叠氮化合物脱脱脱脱羧羧羧羧反反反反应应应应用途用途：酶催化的反应酶催化的反应(三三)由氨基和羧基共同参加的反应由氨基和羧基共同参加的反应（（1）与茚三酮的反应）与茚三酮的反应（（2）形成肽键）形成肽键（（1 1））AAAA与茚三酮反应与茚三酮反应Ø用途用途：常用于氨基酸的定性或定量分析常用于氨基酸的定性或定量分析 (pro pro 黄色黄色））水合茚三酮水合茚三酮茚三酮茚三酮蓝紫色蓝紫色（（2 2）形成肽键（）形成肽键（peptide bondpeptide bond））氨基酸残基与肽单位(四四)由支链由支链R基产生的反应基产生的反应二硫硝基苯甲酸反应，二硫硝基苯甲酸反应，NTNBNTNB第三节 肽的结构和生理功能谷胱甘肽（谷胱甘肽（GSH）的一级结构）的一级结构肽概述(1)形成：脱水缩合(2)命名：NCA 肽也是以两性离子形式存在，一般为链式结构羧基端为肽也是以两性离子形式存在，一般为链式结构羧基端为C-端，氨基端为端，氨基端为N-端。

书写时，端书写时，N-端在左，端在左，C-端在右N-端端C-端端肽键肽键B 肽的结构不仅取决于氨基酸的种类和数目，而且还取决于肽的结构不仅取决于氨基酸的种类和数目，而且还取决于它们之间的连接次序如它们之间的连接次序如甘氨酰丙甘氨酰丙氨酸氨酸丙氨酰甘丙氨酰甘氨酸氨酸 这是少数几种氨基酸可以形成各式丰富多彩的蛋白质的基础这是少数几种氨基酸可以形成各式丰富多彩的蛋白质的基础 C 肽的命名以肽的命名以C-端的氨基酸为母体，称为某氨酸其它氨基酸残端的氨基酸为母体，称为某氨酸其它氨基酸残基则从基则从N-端开始，依次用某氨酰表示，放在母体前如端开始，依次用某氨酰表示，放在母体前如谷氨酸残基谷氨酸残基半半胱氨酸残基胱氨酸残基甘甘氨酸氨酸残基残基g-谷氨酰半胱氨酰谷氨酰半胱氨酰甘氨酸甘氨酸谷胱甘肽谷胱甘肽简称：简称：g-Glu-Cys-Gly；； g-谷谷-胱胱-甘甘(3)分类：寡肽　VS 　多肽 （构成单元大于10称为多肽）(4)酸碱性：肽链中的游离氨基和羧基的间隔比一般氨基酸中的要大，因此它们之间的静电引力较弱肽中的a-COOH的pK值要比游离氨基酸中的大一些，而末端的a-NH2的pK值要比氨基酸中的小一些，R基区别不大（酸的偏向不酸；碱的偏向不碱）Ø小肽的滴定曲线和氨基酸的滴定曲线很相似，随着电离基团的增加，滴定曲线变得复杂，以至很难用单个侧链基团的解离来分析，因为在同一pH范围内可以有几个侧链解离。

Ø但在给定的pH下，可根据Henderson-Hasselbalch方程确定出占优势的电离态，我们只需应用这样一个规则：当溶液pH大于解离侧链的pK值，占优势的离子形式是该侧链的共轭碱，当溶液的pH小于解离侧链的PK值时，占优势的离子形式是它的共轭酸，即w PH≻PK        [HA]‹[A-] w PH ‹PK        [HA] ≻[A-]例如四肽甘氨酰谷氨酰赖氨酰丙氨酸的解离情况：       H3N+—C—C—N—C—C—    N—C—C—N—C—COOH（PK=3.5） H    O    H          O        H          O         H             H            H         CH2    H    CH2     H    CH3  CH2          CH2COOH     CH2CH2NH3+（PK4=10.2）（PK2=4.5）（PK3=7.8）GlyGluLysAla结构中全为质子化的离子形式溶液的PH 功能团解离（带电）状况-COOH 侧连COOH -NH2 -NH2占优势离子的净电荷小于3.5 —COOH —COOH —+NH3 — +NH3 +23.5-4.5 —COO— —COOH —+NH3 — +NH3 +14.5-7.8 —COO— —COO— —+NH3 — +NH3 07.8-10.2 —COO— —COO— —NH3 — +NH3 -1大于10.2 —COO— —COO— —NH3 — NH3 -2四肽甘氨酰谷氨酰赖氨酰丙氨酸的酸碱性质所以此肽的等电点为：（7.8+4.5）/2=6.15（PK=3.5）（PK3=7.8）（PK2=4.5）（PK4=10.2）谷胱甘肽（谷胱甘肽（GSH）的一级结构）的一级结构生物活性肽生物活性肽活性肽活性肽w在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。

w但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽w如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等多为激素）多为激素）谷胱甘肽的生理功用谷胱甘肽的生理功用w解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性作用；w参与氧化还原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应；w保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基团-SH维持还原状态；w维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用 肽肽的生理功能-活性肽与氨基酸生理差别w 肽以完整的形式被机体吸收(肽通过小肠肠吸收后，直接进入血液循环，将自身能量营养输送到人体各个部位)，小肽也是逆浓度梯度转运，主要依赖H+浓度或Ca2+离子浓度转运小肽转运系统具有转运速度快、耗能低、不易饱和等特点 较氨基酸吸收快速w氨基酸只有20种，功能可数，而肽以氨基酸为底物，可合成上百上千种,可执行复杂生理功能（激素）此外，肽可作载体运载营养因子和离子的载体，带动它们一起运输w肽是信息的信使，以引起各种各样不同的实效的正性或异性生理活动和生化反应调节（蛋白相比执行其它功能更多,但很多情况下活性肽活性较高）w分子量小，容易吸收，易于改造，易于化学合成，而高蛋白（大分子蛋白质）不具备这一特点肽的生理功能-活性肽与蛋白质生理差别 若氨基酸为二度深度开发，肽就是高蛋白的三度深度开发产品第四节 蛋白质的结构和性质w蛋白质的多级结构w蛋白质的结构与功能关系w蛋白质的一些性质4.1 4.1 蛋白质的多级结构蛋白质的多级结构一级结构一级结构--------基本结构基本结构空间结构空间结构二级结构二级结构三级结构三级结构四级结构四级结构蛋白质的结构蛋白质的结构( (一）蛋白质一级结构一）蛋白质一级结构(Primary structure)(Primary structure) ★★ 其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的它是蛋白质生物功能的基础基础。

胰岛素（胰岛素（InsulinInsulin）的一级结构）的一级结构（二）（二） 蛋白质二级结构蛋白质二级结构w 蛋白质的二级结构：蛋白质的二级结构：指一级结构进一步指一级结构进一步盘绕折叠，其主链形成的局部构象盘绕折叠，其主链形成的局部构象w二级结构的类型：二级结构的类型：主要有主要有 - -螺旋、螺旋、 - -折折叠、叠、 - -转角、转角、 无规卷曲无规卷曲w维持二级结构的力：主要是维持二级结构的力：主要是氢键氢键二级结构形成的基础-肽平面w肽平面形成是由于N元素以sp2杂化方式,使其结构中的孤对电子和氧共轭的结果wC元素电子云也以sp2方式杂化导致六个原子在同一平面上 肽平面内各个健的健长和健角肽平面内各个健的健长和健角肽健肽健 肽健（酰胺健）肽健（酰胺健）C－－N长度为长度为0.133nm比比C＝＝N（（0.125nm））长，但比一般的长，但比一般的C－－N单健（单健（0.145nm））短，所以肽健具有部短，所以肽健具有部分双健特性（约具有分双健特性（约具有40％双健特性）％双健特性）肽平面绕肽平面绕N-C 键旋键旋转角度用转角度用 表示表示绕绕C -C键旋转键旋转的角度用的角度用 表示表示从从C 沿健轴方沿健轴方向观察，顺时向观察，顺时针方向为正，针方向为正，反时针为负。

反时针为负NC 羧基碳羧基碳Aa基本结构理论上理论上 和和 可以取可以取－－180°至＋至＋180 °之之间的任一个角度间的任一个角度但由于旋转时酰胺但由于旋转时酰胺氢和羰基氧之间的氢和羰基氧之间的位阻，所以并不是位阻，所以并不是任意二面角（任意二面角（   ，，   ）都是立体化学）都是立体化学所允许的所允许的上图表示肽链中的上图表示肽链中的肽单位处于一种伸肽单位处于一种伸展状态；下图表示展状态；下图表示的是肽单位处于一的是肽单位处于一种不稳定构象，这种不稳定构象，这是由于相邻氨基酸是由于相邻氨基酸残基的羰基氧之间残基的羰基氧之间的立体干扰引起的，的立体干扰引起的，虚线表示的是羰基虚线表示的是羰基氧原子的氧原子的van der Waals半径旋转本身受到肽链的主链和相旋转本身受到肽链的主链和相邻残基的侧链原子之间的立体邻残基的侧链原子之间的立体干扰的限制干扰的限制原子间作用是限制并形成高级构象的动力原子间作用是限制并形成高级构象的动力肽平面和二面角示意图肽平面和二面角示意图ØR R基分布在螺旋的基分布在螺旋的外侧外侧，并且影响着，并且影响着螺旋的形成螺旋的形成。

Ø主链围绕中心轴呈有规律主链围绕中心轴呈有规律螺旋式上螺旋式上升升，形成右手螺旋；，形成右手螺旋；Ø旋转一周为旋转一周为3.63.6个氨基酸残基；螺距个氨基酸残基；螺距为为0.54nm0.54nm；；Ø其结构靠第一个肽平面上的其结构靠第一个肽平面上的-NH-NH基与基与第四个肽平面上的第四个肽平面上的-CO-CO基形成的基形成的氢键氢键维持维持，氢键的取向几乎与轴平行，氢键的取向几乎与轴平行；；（（1 1）） α-α-螺旋的特征螺旋的特征二级结构的类型二级结构的类型（（4条条α-螺旋螺旋）） 原纤维原纤维 微原纤维（微原纤维（11条条α-螺旋）螺旋）巨原纤维巨原纤维纺锤体型纺锤体型皮质细胞皮质细胞角质膜角质膜皮质皮质髓质髓质头发头发头头发发结结构构烫发实际上是一个生物化学过程烫发实际上是一个生物化学过程还原还原做卷做卷氧化氧化纺锤体型纺锤体型皮质细胞皮质细胞含有众多含有众多的二硫键的二硫键左手/右手α- 螺旋影响影响α-α-螺旋稳定的因素螺旋稳定的因素• 极大的侧链基团（存在空间位阻）；极大的侧链基团（存在空间位阻）；• 连续存在的侧链带有相同电荷的氨基酸连续存在的侧链带有相同电荷的氨基酸残基（同种电荷的互斥效应残基（同种电荷的互斥效应) )；；• 有脯氨酸、羟脯氨酸的存在有脯氨酸、羟脯氨酸的存在（不能形成氢键）。

不能形成氢键）（各种聚合氨基酸成螺旋小结）wGly　能形成（无R基团妨碍氢键形成）wAsp lys 不能形成　（侧链带电荷排斥）　　　＊在一定pH范围内wPro 不能形成（不能形成氢键）wLeu不容易形成　(R基团较大，妨碍氢键形成）（（（（2 2 2 2））））β-β-β-β-折迭的特征折迭的特征折迭的特征折迭的特征Ø由由若干条肽段若干条肽段或肽链平或肽链平行或反平行排列组成行或反平行排列组成片状片状结构结构；；Ø主链骨架上下折叠主链骨架上下折叠呈锯呈锯齿状齿状（（AAAA长长0.36nm0.36nm) )；；Ø借相邻借相邻主链之间的氢键主链之间的氢键维系ØR R基基交替分布交替分布在片层的上在片层的上下方二级结构的类型二级结构的类型β-β-折迭包括平行式和反平行式两种类型折迭包括平行式和反平行式两种类型（（（（3 3 3 3）））） β-β-β-β-转角的特征转角的特征转角的特征转角的特征Ø主链骨架本身以大约主链骨架本身以大约180180°°回折回折; ; Ø回折部分通常由四个氨基回折部分通常由四个氨基酸残基构成酸残基构成; ; Ø构象依靠第一残基的构象依靠第一残基的-CO-CO基基与第四残基的与第四残基的-NH-NH基之间形基之间形成氢键来维系。

成氢键来维系二级结构的类型二级结构的类型（（4 4））无规卷曲无规卷曲是指多肽链主链是指多肽链主链部分形成的无规律的部分形成的无规律的卷曲构象卷曲构象对于构造蛋白执行功能的所需的柔性对于构造蛋白执行功能的所需的柔性结构来说具有重要意义结构来说具有重要意义二级结构的类型二级结构的类型View of conformational change:RNase的分子结构的分子结构α-螺旋螺旋β-折迭折迭β-转角转角无规卷曲无规卷曲超二级结构结构域（三）蛋白质的三级结构（三）蛋白质的三级结构溶菌酶分子的三级结构溶菌酶分子的三级结构(1) (1) 主要是非共价键（主要是非共价键（次级键次级键），如疏水键、），如疏水键、氢键、盐键、范氏引力等；氢键、盐键、范氏引力等；(2) (2) 但也有共价键，如二硫键等但也有共价键，如二硫键等疏水作用是维持蛋白质结构疏水作用是维持蛋白质结构最主要的稳定力最主要的稳定力疏水基团因疏水作用而聚向分子内部，亲水基团多分布在分团因疏水作用而聚向分子内部，亲水基团多分布在分子表面因此，具有三级结构的蛋白质都是亲水的因此，具有三级结构的蛋白质都是亲水的 这与生命诞生时的水环境有关这与生命诞生时的水环境有关维系三级结构的力维系三级结构的力 键 能w肽键肽键  w二硫键二硫键w离子键 w氢键氢键w疏水键疏水键 w范德华力范德华力 3kcal/mol1kcal/mol1kcal/mol0.1kcal/mol这四种键能远小于共价键，称这四种键能远小于共价键，称次级键次级键提问：次级键微弱但却是维持蛋白质三级结构中主提问：次级键微弱但却是维持蛋白质三级结构中主要的作用力要的作用力, ,原因何在原因何在? ?数量巨大数量巨大数量巨大数量巨大（四）蛋白质的四级结构（四）蛋白质的四级结构由两条或两条以上具有三级结构的多肽链由两条或两条以上具有三级结构的多肽链相互缔结相互缔结在一起的聚合体。

其中每条具有三级在一起的聚合体其中每条具有三级结构的多肽链为一个结构的多肽链为一个亚基亚基•维系蛋白质四级结构的力是维系蛋白质四级结构的力是次级键次级键•偶数亚基，排列对称偶数亚基，排列对称 血红蛋白血红蛋白(hemoglobin)(hemoglobin)的四级结构的四级结构四级结构优越性1 1、共价键：二硫键、肽键、酯键；、共价键：二硫键、肽键、酯键；2 2、非共价键：氢键、离子键、疏水键、和范德华力、非共价键：氢键、离子键、疏水键、和范德华力一级结构：一级结构：共价键共价键二级结构：二级结构：氢键氢键三、四级结构：三、四级结构：次级键次级键（五）维系蛋白质分子结构的键及作用力（五）维系蛋白质分子结构的键及作用力随着结构层次上升随着结构层次上升, ,键的作用键的作用能力越弱能力越弱, ,符合物质构成一般符合物质构成一般规律规律稳定蛋白质构象的力稳定蛋白质构象的力盐键盐键氢键氢键疏疏水水键键范德华力范德华力二二硫硫键键酯键酯键4.2 蛋白结构和功能关系w　　蛋白质的一级结构决定其高级结构而影蛋白质的一级结构决定其高级结构而影响功能响功能w　蛋白质的高级结构决定了其功能　蛋白质的高级结构决定了其功能(1)(1)蛋白质的一级结构决定其高级结构而影响功能蛋白质的一级结构决定其高级结构而影响功能(1)(1)蛋白质的一级结构决定其高级结构而影响功能蛋白质的一级结构决定其高级结构而影响功能镰状细胞贫血镰状细胞贫血（（sick-cell anemia）从患者红细胞中鉴定出特异）从患者红细胞中鉴定出特异的镰刀型或月牙型细胞。

的镰刀型或月牙型细胞β-链链 1 2 3 4 5 6 7Hb-A Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys…Hb-S Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys… Val 取代取代Glu含氧含氧-HbAO2O2粘性疏水斑点粘性疏水斑点含氧含氧HbS脱氧脱氧HbS疏水位点疏水位点血红蛋白分子凝集血红蛋白分子凝集(2) 蛋白质的高级结构直接决定其功能蛋白质的高级结构直接决定其功能w高级结构变化，其许多结构性质就会改变（如变性失活）w高级结构及构象微调，其活性也会发生很大变化．血红蛋白血红蛋白血红蛋白构象的微调血红蛋白构象的微调- -构象改变构象改变- -生理功能改变生理功能改变血红素在蛋白中的位置血红素在蛋白中的位置血红素血红素氧结合引起蛋白局部构象变化氧结合引起蛋白局部构象变化局部构象变化引发关联蛋白构象变化局部构象变化引发关联蛋白构象变化氧气结合最终引起整体构象变化w氧结合形成的构象改变，改变了四级结构相成的盐键，使其它亚基构象变化，使其它亚基转变为更亲氧构象，形成协同作用．方便了氧的运输．可以通过其它分子限制蛋白构象的微调变化4.3 蛋白质的重要性质( (一一) ) 胶体性质胶体性质 •蛋白质的分子量很大，但它在水中蛋白质的分子量很大，但它在水中能够能够形成胶体溶液形成胶体溶液(蛋白表面有带电蛋白表面有带电基团基团,但不同于化学溶胶吸附金属离但不同于化学溶胶吸附金属离子而带电子而带电)。

蛋白质溶液具有胶体溶蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等运动等•水膜水膜和同种和同种电荷排斥作用电荷排斥作用是胶体稳是胶体稳定的原因定的原因　　利用胶体性质可用于蛋白的分离：蛋白沉淀利用胶体性质可用于蛋白的分离：蛋白沉淀 由前述可知由前述可知, , 维持蛋白质溶液稳定的主要因素是蛋白质分维持蛋白质溶液稳定的主要因素是蛋白质分子表面的水化膜和双电层若用化学或物理的方法破坏蛋子表面的水化膜和双电层若用化学或物理的方法破坏蛋白质的这两种因素，则蛋白质分子将凝聚而沉淀白质的这两种因素，则蛋白质分子将凝聚而沉淀 方法有：方法有：（（1 1）盐析沉淀）盐析沉淀中性盐（硫酸铵）既中和蛋白所带电荷又破坏水化膜中性盐（硫酸铵）既中和蛋白所带电荷又破坏水化膜（（2）有机溶剂沉淀）有机溶剂沉淀w有有机机溶溶剂剂之之所所以以能能使使酶酶沉沉淀淀析析出出，，主主要要是是由由于于有有机机溶溶剂剂的的存存在在会会使使溶溶液液的的介介电电常常数数降降低低例例如如，，20℃时时水水的的介介电电常常数数为为80xl0-12F／／m，，而而82％乙醇水溶液的介电常数为％乙醇水溶液的介电常数为40x10-12F／／mw溶溶液液的的介介电电常常数数降降低低，，就就使使溶溶质质分分子子间间的的静静电电引引力力增增大大，，互互相相吸吸引引而而易易于于凝凝集集。

同同时时，，对对于于具具有有水水膜膜的的分分子子来来说说，，有有机机溶溶剂剂与与水水互互相相作作用用使使溶溶质质分分子子表表面面的的水水膜膜被被破破坏坏，，也也使使其其溶溶解解度度降低而沉淀析出降低而沉淀析出（（3）等电点沉淀法）等电点沉淀法w蛋白颗粒间无电荷的排斥作用，易于形成蛋白颗粒间无电荷的排斥作用，易于形成聚集成大颗粒，不稳定，易于沉淀析出聚集成大颗粒，不稳定，易于沉淀析出（（4）重金属盐沉淀）重金属盐沉淀w重金属盐通常水化半径小，不易水化方式分散在溶液中重金属盐通常水化半径小，不易水化方式分散在溶液中w蛋白质分子上含氧或含氮的基团蛋白质分子上含氧或含氮的基团, 如如RCOO―、、RNH2属于属于硬碱，容易跟硬酸金属离子，如碱金属离子、碱土金属离子硬碱，容易跟硬酸金属离子，如碱金属离子、碱土金属离子和和Fe（（Ⅲ）、）、Al（（Ⅲ）、）、Cr（（Ⅲ）等之间由于正负电荷的）等之间由于正负电荷的吸引作用而生成蛋白质盐吸引作用而生成蛋白质盐（盐析机理）（盐析机理）w而含硫基团，如而含硫基团，如RSH、、RS－和－和R1S-SR2 属于软碱，容易与属于软碱，容易与软酸金属，如软酸金属，如Ag（（Ⅰ）、）、Cu（（Ⅰ）、）、Hg（（Ⅰ）、）、Au（（Ⅰ）、）、Hg（（Ⅱ）、）、Pt（（Ⅱ）等反应，其反应方式偏向于共价力作用）等反应，其反应方式偏向于共价力作用,产物十分稳定产物十分稳定w软酸金属离子与蛋白质硫原子之间形成配合物，软酸金属离子与蛋白质硫原子之间形成配合物， 使蛋白质使蛋白质分子间以金属离子为中心交联形成超级大分子而沉淀分子间以金属离子为中心交联形成超级大分子而沉淀，， 此此时蛋白质变性、沉淀不可逆。

时蛋白质变性、沉淀不可逆（（4）生物碱试剂）生物碱试剂茶叶中的鞣酸还能与食物中的蛋白质结合生成一种块状的、不易消化吸收的鞣酸蛋白，导致便秘症的产生 （羧酸和蛋白碱性基团结合，起搭桥作用（羧酸和蛋白碱性基团结合，起搭桥作用- -聚电解聚电解质沉淀原理）质沉淀原理）（5）变性沉淀w目的分子与非目的分子性质上的差异w对热、表面活性剂、酸碱的稳定性差异w变性后蛋白内部基团暴露，很容易通过分子间相互作用聚集而沉淀•蛋白质在等电点偏酸溶液中带正电荷，蛋白质在等电点偏酸溶液中带正电荷，在等电点偏碱溶液中带负电荷，在等在等电点偏碱溶液中带负电荷，在等电点时为兼性离子电点时为兼性离子•蛋白质是人体重要的缓冲剂蛋白质是人体重要的缓冲剂二）两性解离性质（二）两性解离性质(电性电性) 蛋白质不管肽链有多长仍有自由的蛋白质不管肽链有多长仍有自由的-NH2或或-CO2H存在，在存在，在肽链的侧链也有尚未结合的极性基团，如赖氨酸的氨基、谷氨肽链的侧链也有尚未结合的极性基团，如赖氨酸的氨基、谷氨酸的羧基、半胱氨酸的巯基等酸的羧基、半胱氨酸的巯基等 这些碱性、酸性基团在溶液中会解离（两性离子），解离的这些碱性、酸性基团在溶液中会解离（两性离子），解离的程度与离子的性质、溶液的程度与离子的性质、溶液的pH值、蛋白质中游离基团的性质合值、蛋白质中游离基团的性质合数目等有关。

其两性解离可表示为数目等有关其两性解离可表示为两性两性pH = pI 负离子负离子pH > pI 正离子正离子pH < pI 可见，在酸性溶可见，在酸性溶液中蛋白质解离成液中蛋白质解离成阳离子，在碱性溶阳离子，在碱性溶液中解离成阴离子液中解离成阴离子. .在某个在某个pHpH值时蛋白质成两性离子，所带正负电荷相等值时蛋白质成两性离子，所带正负电荷相等, , 此此pHpH值即为该蛋白质的等电点值即为该蛋白质的等电点( (pIpI), ), 不同的蛋白质有不同的蛋白质有不同的不同的pIpI值１１) ) 测定蛋白质等电点必须在有测定蛋白质等电点必须在有一定离子浓一定离子浓度度的适当缓冲液中进行的适当缓冲液中进行( (离子强度影响离子强度影响H H+ +解离解离) )２２) ) 在水溶液中，蛋白质的等电点一般偏酸，在水溶液中，蛋白质的等电点一般偏酸， 因为因为羧基的解离度比氨基的大羧基的解离度比氨基的大３３) ) 等电点时等电点时蛋白质的导电性、溶解度、蛋白质的导电性、溶解度、 粘度、渗透压等粘度、渗透压等都是最小都是最小蛋白质的等电点蛋白质的等电点电泳现象电泳现象在不同的在不同的pHpH环境下，蛋白质的电学性质不同。

环境下，蛋白质的电学性质不同♥ 当溶液当溶液pH=pH=等电点时，等电点时，蛋白质粒子净电荷为零，在电场中不移动；蛋白质粒子净电荷为零，在电场中不移动；♥当溶液当溶液pHpH＞等电点时，＞等电点时，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；♥当溶液当溶液pHpH＜等电点时，＜等电点时，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动不同电荷量的蛋白,在纸电泳时,迁移距离不同，距离与pH-pI（蛋白等电点数值）相关（三）蛋白质的变性与复性（三）蛋白质的变性与复性蛋白质的变性蛋白质的变性（（denaturation））在某些物理或化学因素的作用下，天然蛋白在某些物理或化学因素的作用下，天然蛋白质严格的空间结构被破坏（不包括肽键的断质严格的空间结构被破坏（不包括肽键的断裂），从而引起蛋白质若干理化性质和生物学裂），从而引起蛋白质若干理化性质和生物学性质的改变，称为蛋白质的变性性质的改变，称为蛋白质的变性主要是次级键变化）（主要是次级键变化）肽键不变、次级键变化，一级结构不变，分为可逆变性肽键不变、次级键变化，一级结构不变，分为可逆变性（（3 3级以上结构被破坏）与不可逆变性（级以上结构被破坏）与不可逆变性（2 2级）级）蛋白质的变性蛋白质的变性 (the denaturation of proteins)天然蛋白质受物理或化学因素的影响，其共天然蛋白质受物理或化学因素的影响，其共价键不变，但分子内部原有的高度规律性的价键不变，但分子内部原有的高度规律性的空间排列发生变化，致使其原有性质发生部空间排列发生变化，致使其原有性质发生部分或全部丧失。

分或全部丧失引起蛋白质变性的因素引起蛋白质变性的因素 物理因素物理因素ü高温高温----破坏次级键，由于蛋白各基团无规则的破坏次级键，由于蛋白各基团无规则的“各奔东西各奔东西”导导致基团挣脱分子间由次级键形成的内聚力而出现变形现象；致基团挣脱分子间由次级键形成的内聚力而出现变形现象；ü高压高压——蛋白的柔性和可压缩性导致其构象在高压下变化，形成蛋白的柔性和可压缩性导致其构象在高压下变化，形成变性，这种变性是高度可逆的；变性，这种变性是高度可逆的；ü紫外线紫外线——吸收紫外，打断二硫键；吸收紫外，打断二硫键；ü剪切力剪切力——形成气泡，使蛋白分布在气泡和水的相界面上（蛋白形成气泡，使蛋白分布在气泡和水的相界面上（蛋白有两亲性），界面高能量使蛋白结构打开；有两亲性），界面高能量使蛋白结构打开；ü超声波超声波——热效应和剪切效应热效应和剪切效应ü水水——水穿透了蛋白的空洞内部，与内部基团结合水化，使蛋白水穿透了蛋白的空洞内部，与内部基团结合水化，使蛋白分子呈现分子呈现“膨胀膨胀”构象，蛋白构象柔性增加，增加了热变性的构象，蛋白构象柔性增加，增加了热变性的几率引起蛋白质变性的因素引起蛋白质变性的因素化学因素化学因素ü强酸、强碱－破坏盐键（使所有离子带同一种电荷而互斥）强酸、强碱－破坏盐键（使所有离子带同一种电荷而互斥）ü有机溶剂（二甲基甲酰胺）有机溶剂（二甲基甲酰胺）----破坏蛋白内部氢键（相对来说，同破坏蛋白内部氢键（相对来说，同样能形成氢键的乙醇和甲醇破坏能力更差，只能把蛋白变为样能形成氢键的乙醇和甲醇破坏能力更差，只能把蛋白变为“融球融球态态”，而不是溶解态），而不是溶解态）其70%的水溶液消毒作用最强。

浓度过高可使菌体表层蛋白质迅速凝固而妨碍乙醇向内渗透，影响杀菌作用 化学因素化学因素ü尿素尿素——具有和主链相似结构，可具有和主链相似结构，可“溶解溶解”主链，主链外露导致变主链，主链外露导致变性（一是降低蛋白质非极性基因与水的疏水作用性（一是降低蛋白质非极性基因与水的疏水作用, , 二是溶剂对蛋白二是溶剂对蛋白质内部酞胺键的亲和力增强；而尿素与蛋白质形成氢键能力并不比质内部酞胺键的亲和力增强；而尿素与蛋白质形成氢键能力并不比水强）水强）ü去污剂（去污剂（SDSSDS））----可实现蛋白内部疏水基团增溶可实现蛋白内部疏水基团增溶ü苯酚苯酚- -盐键破坏假说；疏水性溶剂且能通过蛋白表面水膜进入蛋白盐键破坏假说；疏水性溶剂且能通过蛋白表面水膜进入蛋白分子内部启动变性，己烷等不溶解蛋白但不变性蛋白）分子内部启动变性，己烷等不溶解蛋白但不变性蛋白）ü醛醛——由于蛋白表面亲水的羟基和氨基多为亲核试剂，容易发生分由于蛋白表面亲水的羟基和氨基多为亲核试剂，容易发生分子内交联而破坏蛋白构象毒性，但不算变性）子内交联而破坏蛋白构象毒性，但不算变性） 引起蛋白质变性的因素引起蛋白质变性的因素化学因素化学因素—常见盐常见盐w盐离子可以明显提高蛋白的溶解性。

在促进蛋白稳盐离子可以明显提高蛋白的溶解性在促进蛋白稳定上，常见的一些盐离子作用大小依次是定上，常见的一些盐离子作用大小依次是(CH3)4 N > NH4 > K > Na > Mg > Ca > SO4 > Cl > NO3 > ClO4 > SCNw 靠近序列左侧靠近序列左侧的离子对蛋自质的稳定作用越强，的离子对蛋自质的稳定作用越强，这些盐能增加蛋白质周围的水簇，引起系统总自由这些盐能增加蛋白质周围的水簇，引起系统总自由能损失（水的熵降低，也可看成水分子受约束，降能损失（水的熵降低，也可看成水分子受约束，降低了对蛋白质膨胀及碰撞失活低了对蛋白质膨胀及碰撞失活,或降低了水分子化学或降低了水分子化学反应活性）反应活性）化学因素化学因素—重金属盐重金属盐（1）在医药上，FeCl3可用作止血剂，就是利用了重金属离子对蛋白质的凝固作用；红汞常用于脓、伤口表面的消毒，就是利用了汞离子的杀菌作用；有的眼药水是用很稀的AgNO3溶液配制成的，就是利用了Ag+的杀菌消毒作用．（2）在农药上，广泛使用的“波尔多液”是由石灰乳和胆矾制成的，就是利用了Cu2+的杀菌、杀虫作用．（3）在日常生活中，许多人都知道用Ag、Pt、Au等器皿盛放的食物不易变质，就是由于溶解在食物中的极少量的Ag+、Pt+、Au3+等离子能杀死细菌的缘故．机理：（1）结合上蛋白质盐键，形成不溶解性的重金属盐；             （2）破坏二硫键Ø物理性质：物理性质：旋光性改变旋光性改变溶解度下降溶解度下降沉降率升高沉降率升高光吸收度增加光吸收度增加Ø化学性质：化学性质：官能团反应性增加官能团反应性增加易被蛋白酶水解易被蛋白酶水解Ø生物学性质：生物学性质：原有生物学活性丧失原有生物学活性丧失抗原性改变抗原性改变都与蛋白构象改变\基团外露有关变性蛋白质的特征变性蛋白质的特征变性与凝胶形成-卤水点豆腐疏水作用疏水作用氢键结合氢键结合离子键离子键配位键配位键w二价阳离子如钙离子，除二价阳离子如钙离子，除了中和胶体电荷外，还可了中和胶体电荷外，还可通过配位键搭桥方式帮助通过配位键搭桥方式帮助凝胶网状结构形成凝胶网状结构形成w这是因为变性蛋白上有很这是因为变性蛋白上有很多提供电子对的羟基和羧多提供电子对的羟基和羧基，而钙离子提供四个空基，而钙离子提供四个空轨道配对的，它可在多个轨道配对的，它可在多个变性蛋白松散链间起到搭变性蛋白松散链间起到搭桥作用。

桥作用•蛋白质的变性如不超过一定的限度，蛋白质的变性如不超过一定的限度，经适当处理后，可重新变为天然蛋白质，经适当处理后，可重新变为天然蛋白质，这种现象称为蛋白质的复性这种现象称为蛋白质的复性•与导致变性的因素、蛋白质种类、蛋与导致变性的因素、蛋白质种类、蛋白质分子结构的改变程度相关白质分子结构的改变程度相关蛋白质的复性蛋白质的复性（（renaturationrenaturation））核核糖糖核核酸酸酶酶的的变变性性与与复复性性（四）蛋白质的颜色反应（四）蛋白质的颜色反应双缩脲：是两分子的尿素经加热失去一分双缩脲：是两分子的尿素经加热失去一分子子NHNH3 3而得到的产物而得到的产物双缩脲反应：双缩脲反应：双缩脲双缩脲 / / 两个两个以上肽键的多肽以上肽键的多肽 + + 碱性硫碱性硫酸铜酸铜→→ 紫红色或蓝紫色紫红色或蓝紫色络合物络合物为数不多的利用蛋白整体性质的显色反应为数不多的利用蛋白整体性质的显色反应反应名称反应名称试试 剂剂颜色颜色反应有关基团反应有关基团有有此此反反应应的的蛋蛋白白质质或或氨氨基酸基酸双缩脲反应双缩脲反应NaOH、、CuSO2紫紫色色或或粉粉红红色色二个以上肽键二个以上肽键所有蛋白质所有蛋白质米伦反应米伦反应HgNO3、、Hg(NO3)2及及HNO3混合物混合物红色红色 Tyr黄色反应黄色反应浓浓HNO3及及NH3黄色、橘色黄色、橘色 Tyr、、Phe乙醛酸反应乙醛酸反应(Hopking-Cole反反应应)乙乙醛醛酸酸试试剂剂及及浓浓H2SO4紫色紫色 Trp坂口反应坂口反应(Sakaguchi反应反应)α-萘酚、萘酚、NaClO红色红色胍基胍基Arg酚试剂反应酚试剂反应(Folin-Cioculteu反应反应)碱碱 性性 CuSO4及及 磷磷钨酸钨酸-钼酸钼酸蓝色蓝色酚基、吲哚基酚基、吲哚基Tyr茚三酮反应茚三酮反应茚三酮茚三酮蓝色蓝色自由氨基及羧基自由氨基及羧基α-氨基酸氨基酸 蛋白质的颜色反应蛋白质的颜色反应—OHN第五节 蛋白质研究相关技术w分离w测序w鉴定5.1 蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化 生物组织生物组织前处理前处理前处理前处理 　　　　粗分级粗分级粗分级粗分级 无细胞提取液无细胞提取液　　　　　　　　　　　　细分级细分级细分级细分级 浓缩的蛋白质溶液浓缩的蛋白质溶液 　　　　 精制品精制品( (结晶结晶结晶结晶/ / / /冻干粉冻干粉冻干粉冻干粉) ) ) )盐析盐析盐析盐析 等电点沉淀等电点沉淀等电点沉淀等电点沉淀 超滤超滤超滤超滤 有机溶剂分级有机溶剂分级有机溶剂分级有机溶剂分级（一）分离纯化的一般程序（一）分离纯化的一般程序（一）分离纯化的一般程序（一）分离纯化的一般程序破碎破碎破碎破碎 溶解溶解溶解溶解 离心离心离心离心层析层析 电泳电泳（二）分离方法分类介绍 (１)分子大小（蛋白质的透析）利用物质分子量、密度、形状的不同，利用物质分子量、密度、形状的不同，经超速离心后分布于不同的液层而分离。

经超速离心后分布于不同的液层而分离超速离心也可用来测定蛋白质的分子量，超速离心也可用来测定蛋白质的分子量，蛋白质的分子量与其沉降系数蛋白质的分子量与其沉降系数S S成正比 (１１) )　分子大小（超速离心）　分子大小（超速离心）(１)　分子大小(凝胶过滤分离蛋白质凝胶过滤分离蛋白质)n概念：概念： 在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称为盐析称为盐析n常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等 (２２)溶解度溶解度-盐析盐析盐析时，溶液的盐析时，溶液的pHpH在蛋白质的在蛋白质的等电点处等电点处效果最好效果最好盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性分段盐析：半饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆球蛋白，分段盐析：半饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆球蛋白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白２２)溶解度溶解度-盐析盐析n 凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋白质。

蛋白质n沉淀原理是：沉淀原理是：A A、脱蛋白胶体上水膜作用；、脱蛋白胶体上水膜作用；B B、使水的介电常数降低，蛋白分子异种、使水的介电常数降低，蛋白分子异种电荷相互吸引力增加电荷相互吸引力增加, ,蛋白质溶解度降低蛋白质溶解度降低 ( (２２) )溶解度溶解度- -有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀n n图图图图 通过通过通过通过DEAE-DEAE-DEAE-DEAE-纤维素将两种不同带电性的蛋白质分离开纤维素将两种不同带电性的蛋白质分离开纤维素将两种不同带电性的蛋白质分离开纤维素将两种不同带电性的蛋白质分离开n n图中显示的是带正电的离子交换树脂结合带负电的蛋白图中显示的是带正电的离子交换树脂结合带负电的蛋白图中显示的是带正电的离子交换树脂结合带负电的蛋白图中显示的是带正电的离子交换树脂结合带负电的蛋白( (３３) )电荷差异（离子交换层析）电荷差异（离子交换层析）( (４４) )亲和特性（亲和层析）亲和特性（亲和层析）(1)(1)、末端分析、末端分析N N－末端测定－末端测定SangerSanger法法EdmanEdman法法DNSDNS法法氨肽酶法氨肽酶法C C－末端测定－末端测定肼解法肼解法羧肽酶法羧肽酶法5.2 5.2 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定2 2、二硫键的拆开和肽链的分离、二硫键的拆开和肽链的分离3 3、肽链的部分水解和肽段的分离、肽链的部分水解和肽段的分离（（1 1）溴化氰裂解）溴化氰裂解（（2 2）部分酸水解）部分酸水解（（3 3）酶水解（牢记四种酶解方式））酶水解（牢记四种酶解方式）常考察内容w酸碱wCNBrw酶（（1 1）酸水解）酸水解w常常用用6 mol/L的的盐盐酸酸或或4 mol/L的的硫硫酸酸在在105-110℃条条件件下下进进行行水水解解，，反反应应时时间间约约20小时。

小时w此此法法的的优优点点是是不不容容易易引引起起水水解解产产物物的的消消旋旋化缺点是色氨酸被沸酸完全破坏化缺点是色氨酸被沸酸完全破坏；；w含含有有羟羟基基的的氨氨基基酸酸如如丝丝氨氨酸酸或或苏苏氨氨酸酸有有一一小小部部分分被被分分解解；；天天门门冬冬酰酰胺胺和和谷谷氨氨酰酰胺胺侧侧链的酰胺基被水解成了羧基链的酰胺基被水解成了羧基肽链的水解方式肽链的水解方式（２）碱水解（２）碱水解w一般用一般用5 mol/L氢氧化钠煮沸氢氧化钠煮沸10-20小时w由由于于水水解解过过程程中中许许多多氨氨基基酸酸都都受受到到不不同同程程度的破坏度的破坏，产率不高产率不高w部分的水解部分的水解产物发生产物发生消旋化消旋化w该法的优点是该法的优点是色氨酸色氨酸在水解中不受破坏在水解中不受破坏（３）部分酸水解w稀酸　　Asp的羧基端w浓酸　　羟基氨基酸的氨基端（４）CNbr裂解wMet的羧基端w专一性好，切点少（５）酶水解（５）酶水解w目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶（proteolytic enzyme）或称蛋白酶（proteinase）已有十多种w应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化水解的产物为较小的肽段。

  w最常见的蛋白水解酶有以下几种：wTrypsin ：：R1=赖氨酸赖氨酸Lys和精氨酸和精氨酸Arg侧链侧链（专一性较强，水解速度快）（专一性较强，水解速度快）w碱性氨基酸羧基端碱性氨基酸羧基端水解位点水解位点胰胰蛋蛋白白酶酶w胰凝乳蛋白酶（胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：）：R1=苯苯丙氨酸丙氨酸Phe,色氨酸色氨酸Trp,酪氨酸酪氨酸Tyr; 亮氨酸亮氨酸Leu，蛋氨酸，蛋氨酸Met和组氨酸和组氨酸His水解稍慢水解稍慢w芳香氨基酸羧基端芳香氨基酸羧基端糜糜蛋蛋白白酶酶水解位点水解位点wPepsin：：R1=苯丙氨酸苯丙氨酸Phe,色氨酸色氨酸Trp,酪氨酪氨酸酸Tyr; 亮氨酸亮氨酸Leu水解速度较快水解速度较快w主要是酸性氨基酸和芳香氨基酸羧酸端主要是酸性氨基酸和芳香氨基酸羧酸端胃胃蛋蛋白白酶酶水解位点水解位点wthermolysin：：R2=苯丙氨酸苯丙氨酸Phe,色氨酸色氨酸Trp,酪氨酸酪氨酸Tyr; 亮氨酸亮氨酸Leu，异亮氨酸，异亮氨酸Ileu,蛋氨蛋氨酸酸Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快嗜嗜热热菌菌蛋蛋白白酶酶水解位点水解位点4、测定每一段氨基酸顺序、测定每一段氨基酸顺序(edman降解降解)5、由重叠片段推断肽链顺序、由重叠片段推断肽链顺序6 、确定二硫键位置、确定二硫键位置确定二硫键位置确定二硫键位置(一一) 氨基酸的分析氨基酸的分析纸层析法纸层析法:利用极性与非极性氨基酸在水和利用极性与非极性氨基酸在水和有机溶剂中的溶解度不同的特点，在滤有机溶剂中的溶解度不同的特点，在滤纸上进行分离的方法纸上进行分离的方法(分配层析分配层析);柱层析法：根据氨基酸的柱层析法：根据氨基酸的离子交换离子交换反应的原反应的原理，如理，如HPLC;薄层层析法：利用薄层层析法：利用吸附吸附原理进行层析的方法，原理进行层析的方法，在玻板上的薄层吸附剂上进行。

在玻板上的薄层吸附剂上进行5.3 5.3 蛋白的鉴定及定量蛋白的鉴定及定量One-Dimensional One-Dimensional 单向层析单向层析Known SampleKnown SampleYXRf=X/Y?Filter-paper ChromatographyTwo-Dimensional Two-Dimensional 双向层析双向层析溶剂前沿Thin-layer ChromatographyThin-layerThin-layer1cmHPLCmAU（二）（二） 蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定(1) (1) 紫外光吸收法紫外光吸收法: :此法是用紫外吸收此法是用紫外吸收分光光度计在紫外光区测定蛋白质的分光光度计在紫外光区测定蛋白质的光吸收，从而测定蛋白质含量的方法光吸收，从而测定蛋白质含量的方法 (2) 双缩脲法双缩脲法w在强碱性溶液中，蛋白质与在强碱性溶液中，蛋白质与CuSO4反应，生成紫红色反应，生成紫红色化合物，这个反应称为化合物，这个反应称为双缩脲反应双缩脲反应（（biuret reaction)w在碱性条件下，蛋白质与在碱性条件下，蛋白质与CuSO4所生成的颜色深浅与所生成的颜色深浅与蛋白质的浓度成蛋白质的浓度成正比正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸，而与蛋白质的分子量及氨基酸组成无关。

将样品同标准蛋白质同时试验，并于组成无关将样品同标准蛋白质同时试验，并于540--560nm波长下侧其波长下侧其光吸收值光吸收值，通过标准曲线曲线即可，通过标准曲线曲线即可求得蛋白质的含量求得蛋白质的含量w此方法简便、迅速，不受蛋白质特异性的影响，但方此方法简便、迅速，不受蛋白质特异性的影响，但方法的灵敏度较差，所需样品量大（法的灵敏度较差，所需样品量大（0.2-1.7mg/ml）(3)福林一酚试剂法福林一酚试剂法w福林一酚试剂（福林一酚试剂（Folin-phenol reagent ) （酪（酪氨酸），在碱性条件下很容易将磷钼酸和磷氨酸），在碱性条件下很容易将磷钼酸和磷钨酸还原为蓝色的钼蓝和钨蓝，所生成蓝色钨酸还原为蓝色的钼蓝和钨蓝，所生成蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，因此，在的深浅与蛋白质的含量成正比，因此，在650nm或或660nm波长下测定光吸收值，即可测波长下测定光吸收值，即可测定蛋白质含量定蛋白质含量 下课了！下课了！。