高效液相色谱法测定人体内对乙酰氨基酚的唾药浓度.docx

    高效液相色谱法测定人体内对乙酰氨基酚的唾药浓度    【摘要】目的建立一种测定人唾液中对乙酰氨基酚浓度的HPLC法方法受试者服用对乙酰氨基酚片，分别于不同时间点采集受试者的唾液，唾液样品用1.5倍量的10%高氯酸和0.5倍量的乙腈沉淀蛋白色谱柱为DikmaTechnologiesDiamonsilTMC18(5μm,250×4.6mm)，流动相为甲醇-水（20：80，V/V），流速为1ml?min-1，柱温为室温，紫外检测波长245nm结果唾液中内源性物质对样品测定无干扰本方法线性范围为0.025-12.5μg?mL-1（r=0.9999），最低定量浓度为0.025μg?mL-1，方法回收率为99.02%-102.19%，精密度等均符合方法学要求结论本法简便、准确，适用于对乙酰氨基酚唾药浓度测定关键词】对乙酰氨基酚HPLC唾药浓度R446A2095-1752（2013）01-0086-03前言对乙酰氨基酚(paracetamol，Acetaminophen)俗称扑热息痛、醋氨酚、退热净1878年由莫尔斯(Morse)首次合成1893年由VonMering首先用于临床，直到1949年当它被认为是乙酰苯胺(退热冰)和非那西丁的活性代谢产物时，才得到普遍应用。

在美国从1955年就成为非处方药品我国于1960年开始生产现在临床常用于治疗感冒发热、头痛等症状，其疗效好、见效快、副作用比非那西丁小，成为解热镇痛药中的主要品种之一[1]目前对乙酰氨基酚含量测定的方法主要有分光光度法、高效液相色谱法、滴定法、毛细管电泳法等但利用高效液相色谱法测定对乙酰氨基酚唾药浓度的研究还未见报道本文通过优化实验条件，成功建立了一种测定对乙酰氨基酚唾药浓度的液相色谱分析方法该法简便、准确、灵敏度高、检测范围宽，可用于对乙酰氨基酚生物样品的测定1仪器和试剂高效液相色谱仪（DIONEXP680HPLC），分析天平(sartorius型号BP211D),KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），TDA-Genpure超纯水机；对乙酰氨基酚对照品(中国药品生物制品检定所，批号100018-200408)，对乙酰氨基酚片（广东华南药业集团有限公司，生产批号070806），甲醇（Fisher，色谱纯），其他试剂均为分析纯2方法学的建立2.1色谱条件选择DionexP680泵，UVD170U紫外光检测器，色谱柱：DikmaTechnologiesDiamonsilTMC18(5μm,250×4.6mm)；流动相：甲醇/水=（20：80，V/V）；流速：1ml?min-1；柱温：室温，检测波长245nm，采用20μL定量环进样。

2.2蛋白沉淀剂的选择因生物样品中的蛋白会损坏色谱柱，并且影响样品峰形和样品的含量测定，所以对蛋白沉淀溶剂进行了一定的选择常用的蛋白沉淀溶剂有：甲醇，乙腈，丙酮，高氯酸,正丙醇考察方法：（1）采集空白唾液，以3000r/min离心10min，分别取一定量的上清液于各离心管中，再分别加入3倍量的甲醇，乙腈，丙酮，高氯酸,正丙醇，涡旋混匀，静置，肉眼观察，各蛋白沉淀剂中乙腈，正丙醇，高氯酸沉淀蛋白效果稍好，甲醇，丙酮其次2）经考察以上各种蛋白沉淀剂除蛋白效果没有太大差异，所以主要从峰形进行考虑通过分别配制不同沉淀剂或者不同比例沉淀剂再分别加入一定量的标准溶液进高效液相色谱仪进行峰形考察(在本色谱条件下，对乙酰氨基酚的保留时间为10.5min左右)综合以上结果，甲醇峰形对称但除蛋白效果一般，而纯丙酮、正丙醇、乙腈峰形不对称；因乙腈除蛋白效果好，所以最终选择1.5倍量10%高氯酸和0.5倍量乙腈混合液沉淀蛋白，峰形对称除蛋白效果也较佳(如图1所示)2.3取样影响因素考察2.3.1吞咽次数考察考察取样时吞咽次数对唾液中对乙酰氨基酚浓度的影响，受试者口服对乙酰氨基酚片500mg（一片），服用后第40分钟取样，再分别吞咽1、2、3、4、5次取样五份，按“唾液样品处理”项下制备样品，按“2.1”项下进行测定，结果（如表1）：表1吞咽次数考察结果结果表明同一时间不同吞咽次数取的样品中对乙酰氨基酚浓度差别不大，表明吞咽次数对样品浓度影响不大。

2.3.2喝水时间考察考察取样前喝水的时间的影响，做了以下实验：在70min取了样后，立即喝水后取样，再分别隔1，2，3，4，5min取样五份，按“唾液样品处理”项下制备样品，按“2.1”项下进行测定，结果（如表2）：表2喝水时间考察结果结果表明最好在取样的前5分钟内不要喝水，以免稀释了唾液中药物浓度2.4受试者的选择四女一男年龄23～25岁，体重45～60kg；不嗜烟酒，身体健康无心、肝、肾、消化道、代谢异常等病史心电图、血压、肝、肾、肺功能等常规体检正常；无药物过敏史和神经系统疾病史；心率60～90次?min-1；两周前至试验期间未服用其他药物2.5溶液配制2.5.1对照品储备液的制备精密称定对乙酰氨基酚对照品0.1000g，置1000mL量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液（C=100μg?mL-1）2.5.2对照品溶液的制备精密量取1、3、4、5ml对照品储备液于10mL容量瓶加蒸馏水至刻度，配成C(对乙酰氨基酚)=10、30、40、50μg?mL-1的对乙酰氨基酚溶液；再分别从10、50μg?mL-1的对乙酰氨基酚溶液的中精密量取1mL分别置于另一10.0mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，配成1、5μg?mL-1的对乙酰氨基酚溶液；再从1μg?mL-1的对乙酰氨基酚溶液中精密量取1、2mL分别置于另一10.0mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，配成0.1、0.2μg?mL-1的对乙酰氨基酚溶液；再于从0.1μg?mL-1的对乙酰氨基酚溶液中精密量取1mL分别置于另一10.0mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，配成0.08μg?mL-1的对乙酰氨基酚溶液，将各浓度标准溶液置4℃冷藏待用。

2.5.3唾液样品处理采集唾液0.5-1.0mL，以3000r/min离心10min，取上述上清液400μL，加入1.5倍量（即600μL）的高氯酸和0.5倍量（即200μL）的乙腈，涡旋混匀，以6000r/min离心10min，取离心后样品的上清夜，用0.22μm的微孔滤膜滤于干净的离心管中，进样3方法学考察与评价3.1方法的专属性取对乙酰氨基酚10μg?mL-1标准溶液直接进样，得标准品色谱图(如图2所示)；取空白唾液0.5mL，按“唾液样品处理”项下操作，得空白唾液色谱图(如图3所示)；取受试者唾液样品，按“唾液样品处理”项下操作，得受试者样品色谱图(如图4所示)对乙酰氨基酚保留时间为10.5min左右，唾液内源性物质不干扰测定3.2线性关系考察采集空白唾液，以3000r/min离心10min，取上述上清液0.1ml，加入“对照品溶液的制备”项下各个浓度下的标准溶液0.3ml，以及0.6ml10%高氯酸溶液和0.2ml乙腈，涡旋混匀，以6000r/min离心10min，取离心后样品的上清夜，用0.22μm的微孔滤膜滤于干净的离心管中，得到下列浓度12.5、10、7.5、2.5、1.25、0.25、0.125、0.05、0.025μg?mL-1、0.020μg?mL-1。

分别精密吸取以上不同浓度对照品溶液,进样记录峰面积，以对照品峰面积为纵坐标，以对照品浓度为横坐标进行线性回归，回归方程为：Y=1.199X+0.0039，r=0.9999线性范围为：0.025-12.5μg?mL-1最低检测限为25ng?mL-1（见表3）表3各对照品浓度峰面积值3.3精密度试验用空白唾液配制低、中、高(0.125、1.25、12.5μg?mL-1)三个浓度的对乙酰氨基酚标准系列溶液，每个浓度连续进样六次，测定其峰面积（mAu?min），进行精密度测定，RSD分别为0.39%、0.62%、0.91%（见表4）表4精密度试验结果(n=6)3.4稳定性试验用空白唾液配制低、中、高(0.125、1.25、12.5μg?mL-1)三个浓度的对乙酰氨基酚标准系列溶液，分别在0，0.5，1，2，24h进行测定，测定其峰面积（mAu?min）考察其稳定性结果表明：对照品溶液在24h内稳定性良好，低、中、高三个浓度平均RSD分别为0.55%、1.18%、0.29%（见表5）表5稳定性试验结果峰面积（mAu?min）3.5重现性试验取同一样品溶液（受试者第40min样品），按“唾液样品处理”项下方法制备，平行制备6份样品，按“2.1”项下平行测定6次，得出样品中对乙酰氨基酚浓度分别为2.4064、2.393、2.4011、2.3319、2.3092，2.2744μg?mL-1，其平均浓度为2.3527μg?mL-1，RSD为2.35%（见表6）。

表6重现性试验结果(n=6)3.6回收率试验取处理后的空白唾液上清液100μL，精密加入100μL已知含量（5μg?mL-1）的对照品溶液共9份再分别精密加入100μL高、中、低三个浓度（50、5、0.5μg?mL-1）的对乙酰氨基酚对照品溶液，每一浓度3份，按“唾液样品处理”项下方法制备，按“2.1”项下测定，计算方法的平均回收率结果见表7表7回收率试验结果(n=9)3.7样品测定3.7.1供试品的制备及结果健康受试者4名口服对乙酰氨基酚片500mg（一片），给药后于10min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min、100min、2h、2.5h、3h、4h、6h、12h、24h取样，收集唾液量不低于0.5ml，将采集的样品编号，按“唾液样品处理”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下测定，得出样品峰面积A（mAu?min）根据标准曲线：以对照品峰面积为纵坐标，以对照品浓度为横坐标进行线性回归，回归方程为：Y=1.199X+0.0039，r=0.9999计算样品中对乙酰氨基酚浓度C，结果见表8表8样品中对乙酰氨基酚峰面积A（mAu?min）；浓度C(μg?mL-1)注：标*号的数据不性检测范围内，无意义，弃去。

3.7.2结果分析根据受试者的不同时间点的唾药浓度如上，以四位受试者的不同时间点的平均唾药浓度为纵坐标，时间为横坐标得四位受试者唾液中对乙酰氨基酚浓度均值-时间曲线，如图5所示根据受试者唾液中对乙酰氨基酚浓度均值-时间曲线及有关文献[2]可知，对乙酰氨基酚体内代谢过程均符合单室模型所以按照单室血管外给药模型有关公式计算药物动力学参数，平均主要动力学参数见表9,各个受试者的药动学参数见表10，为药代动力学进一步深入研究提供依据表9主要药物动力学参数4结论通过该实验方法学考察结果：精密度、重现性、稳定性及回收率均符合方法学要求，表明该方法简便，准确整个实验过程顺利，未见不良反应发生；并且从药一时曲线图形来看，各受试者的对乙酰氨基酚体内代谢过程均符合单室血管外给药模型5讨论5.1流动相的选择文献[3]报道流动相选择0.01mol.L-1磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH至2.6±0.1)一甲醇(70:30)，因磷酸盐易在色谱柱中结晶，不易冲洗，没有选择文献[4]报道流动相选择甲醇一水(45:55)，文献[5]流动相选择乙腈：水：冰乙酸=15：85:0.1文献[2]报道选择乙腈一水(10:90)为流动相。

本实验选择甲醇/水=（20：80,V/V）为流动相5.2各受试者样品测定结果差异较大，其中原因除了人体个体差异，饮食之外，还有实验过程各受试者可能取样操作不一致导致的误差及样品处理过程产生的误差5.3采用高效液相色谱法测定人体内对乙酰氨基酚的唾药。