生化-酶活(修复的).doc

山东大学实验报告2013 年 4 月 21 口姓名陈少坤 科目生化系年级2011级生科2班 同组者 张劲松实验步骤题目纤维素酶活力的测定-3, 5二硝基水杨酸法 仪器编号西一、 实验目的掌握还原糖的测定原理，学习用3, 5-二硝基水杨酸法测定还原糖的方法二、 实验原理纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3, 5-二硝 基水杨酸中硝基还原成橙黄色的氨基化合物,利用比色法测定其还原物生 成量来表示酶的活力三、 实验用品试剂1. 3, 5-二硝基水杨酸显色液：称取10g 3, 5-二硝基水杨酸，溶入蒸饰水 中，加入20g分析纯氢氧化钠，200g酒石酸钾钠,加水500ml,升温溶解 后，加入重蒸酚2g,无水亚硫酸钠0.5g加热搅拌，待全溶后冷却，定 容至1000mlo存于棕色瓶中，放置一周后使用2. 0. 1摩尔pH4・5乙酸-乙酸钠缓冲溶液3. 0.5%竣甲基纤维索钠水溶液，溶解后成胶状液，静置过夜使用前摇 匀4. 标准葡萄糖溶液：称取干燥至恒重的葡萄糖100mg,溶解后定容至 100ml,此溶液含葡萄糖l.OOmg/mlo5•酶液:将0.05g酶溶解定容至50ml,从中取出lml再定容至100ml, 待测。

用pH4. 5乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制）器材1. 比色管10支2. 722型分光光度计3. 滴管4. 水浴锅5. 移液枪6. 电炉四、1. 空白管的测定:取Ind酶液，沸水浴5分钟,冷却加3ml0. 5%CMC,与样品管同时放入50度水浴30分钟英它操作同样品管2. 样品的测定：取0.5%竣甲基纤维素钠溶液3ml,酶液lml,于50度水 浴中糖化30分钟,取出,立即于沸水浴中煮沸10分钟使酶失活，得 糖化液，冷却加入3nd显色液，再沸水浴10分钟，冷却后加水定容至 25ml,混匀,550nm 测 0D 值二、测西瓜汁中还原糖浓度3. 取3ml西瓜汁定容至1000ml o4. 标准曲线的绘制:分别吸取0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 ml的葡萄糖于 5支比色管中，均用蒸懈水稀释至lml,加3. 5-二硝基水杨酸显色剂 3ml,在沸水浴中煮沸显色10分钟，冷却，加蒸馄水21ml,摇匀以 linl蒸憾水代替糖作空口管，在550nni处比色以光密度为纵坐标， 以葡萄糖微g数为横坐标，绘出标准曲线五、 实验记录1实验A0'AlA2A3Abs00. 6510. 6490. 670平均值0. 6567在上述条件下，1畔酶每分钟催化纤维索水解生成葡萄糖微克数定为一个活 力单位。

纤维素酶活力单位=(N X 0D值对应的葡萄糖量)/(30Xl)N---酶液的稀释倍数30---糖化所用吋间1 反应酶液ml数酶液 10ug/ml2实验123456789标糖ml00.20.40.60.81.0西瓜汁ml0.50.50.5水ml1.00.80.60.40.200.50. 50.5显色剂加入3ml显色剂，沸水浴lOmin,冷却，加水定容25ml,混匀550nm00. 1410.282 0.4160. 5470. 6830. 3690. 3660. 368注：标糖lmg/ml 做图0D值(550nm)y = 0.0007x + 0.0043..e1000 1200600 8004002008 7 6 5 • • • • o o o O (UJUOSS) UQO一 ・ ・ 一 • O4 3 2 1 0 • • • • o o o Ofil/ug取平均值Y=0. 3666代入公式得X二532 即得出西瓜汁中述原糖是354. 6mg/ml对于实验1中平均含量Y=0. 6567代入公式得 X=932纤维素酶活单位=932/ （30X1X104-1000 ） =3. 106X 103ug/（min • mg）六、 注意1. 在测定0D值过程中，绘制标准曲线时要用1号葡萄糖标准液（葡萄糖 浓度为0）调零，测定样品0D值时要用样品空白液调零。

从实验原理 上看，这样做的目的是：无论是标准液还是样品液，都要去除葡萄糖 外的其他各种成分的对0D值的影响得到的标准曲线经过坐标原点2. 在测定时为使各样品和空白管处理一致，应同时加入试剂，同时放入 水浴中，同时取出水浴，以使反应得进行程度一致3. 用移液管或移液枪加各试剂时，不能将移液管或移液枪头混用。