食品中常见病原微生物检验技术(PowerPoint 143页).pptx

第七章第七章 食品中常见病原微生物检验技术食品中常见病原微生物检验技术n我国卫生部颁布的食品微生物指标有菌落总数、大肠菌群和致病菌三项n致病菌：能够引起人类发病的细菌对不同的食品和不同的场合，应该选择一定的参考菌群进行检验一、生物学特性一、生物学特性 是是一一大大群群在在血血清清学学上上相相关关的的革革兰兰氏氏阴阴性性杆杆菌菌，无无芽芽孢孢、无荚膜，周身鞭毛，能运动的需氧或兼性厌氧短杆菌无荚膜，周身鞭毛，能运动的需氧或兼性厌氧短杆菌最最适适生生长长温温度度为为35 35 37 37，最最适适pHpH为为7.27.27.47.4，较较抗寒，抗寒，能耐受较高盐浓度能耐受较高盐浓度第一节第一节沙门氏菌沙门氏菌检验技术检验技术 目前至少有目前至少有6767种种O O抗原和抗原和25002500个以上血清型个以上血清型,根据其对宿主的致病性根据其对宿主的致病性,可分为可分为三类三类伤寒杆菌伤寒杆菌副伤寒杆菌副伤寒杆菌(甲、乙、丙甲、乙、丙)人人肠热症肠热症鼠伤寒杆菌鼠伤寒杆菌肠炎杆菌肠炎杆菌 猪霍乱杆菌猪霍乱杆菌儿童伤寒儿童伤寒人、动物人、动物急性胃肠炎急性胃肠炎猪霍乱杆菌、丙型副伤寒杆菌猪霍乱杆菌、丙型副伤寒杆菌鼠伤寒杆菌、肠炎杆菌鼠伤寒杆菌、肠炎杆菌败血症败血症沙门氏菌属沙门氏菌属(Salmonella)二、检验所需器材二、检验所需器材三、检验程序三、检验程序沙门氏菌检验程序沙门氏菌检验程序2010四、操作方法四、操作方法n分五个步骤：分五个步骤：1.前增菌前增菌n2.选择性增菌选择性增菌n3.选择性平板分离选择性平板分离n4.生化实验生化实验n5.血清型分型鉴定血清型分型鉴定n检测检测沙门氏菌沙门氏菌方法分方法分5个步骤：个步骤：1.1.前增菌：前增菌：在含有营养的在含有营养的非选择性培养基非选择性培养基中增菌，使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的中增菌，使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态。

生理状态沙门氏菌检测中前增菌的目的是沙门氏菌检测中前增菌的目的是使沙门氏菌使沙门氏菌恢复其活力恢复其活力检测经过加工的食品中的沙门氏菌需要前增菌主要因为加工过程中沙门氏菌受到损伤而处于濒死状态2.选择性增菌选择性增菌n 在含在含选择性抑制剂选择性抑制剂的培养基中，样品进的培养基中，样品进一步增菌一步增菌n沙门沙门沙门氏菌检测中增菌的目的沙门氏菌检测中增菌的目的是是使使沙门氏沙门氏菌以外的细菌（主要是艾希氏菌属）受到抑菌以外的细菌（主要是艾希氏菌属）受到抑制，而使沙门氏菌得到一定的增殖，提高沙制，而使沙门氏菌得到一定的增殖，提高沙门氏菌的检出率门氏菌的检出率n3.选择性平板分离选择性平板分离n 划线接种于：划线接种于：nBS和和XLD琼脂平板或琼脂平板或HE琼脂平板各一个，于琼脂平板各一个，于36+1分别培养分别培养1824小时小时(XLD、HE)或或4048小时小时(BS)n 这一步采用这一步采用固体固体选择性培养基，抑制非沙门氏菌的生长，提选择性培养基，抑制非沙门氏菌的生长，提供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别亚硫酸亚硫酸铋琼脂铋琼脂(BS(BS琼脂琼脂)上典型特征上典型特征木糖赖氨酸脱氧胆盐（木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂上典型特征HEHE琼脂上琼脂上典型特征4.4.生物化学试验筛选生物化学试验筛选n 挑取选择性琼脂平板上的可疑菌落，挑取选择性琼脂平板上的可疑菌落，接种于三糖铁琼脂培养基中。

接种于三糖铁琼脂培养基中n 排除大多数非沙门氏菌也提供了排除大多数非沙门氏菌也提供了沙门氏菌培养物菌属沙门氏菌培养物菌属的初步鉴定的初步鉴定TSI(三糖铁三糖铁)培养基培养基大肠杆菌和沙门氏菌大肠杆菌和沙门氏菌沙门菌常用生化试验沙门菌常用生化试验尿素酶试验尿素酶试验阴性（黄）阳性（红）阴性（黄）阳性（红）靛基质对照管对照管阴性阴性()阳性阳性()P150（1）A1：典型反应判定为沙门氏菌属如尿素、氰化钾和赖氨：典型反应判定为沙门氏菌属如尿素、氰化钾和赖氨酸脱羧酶酸脱羧酶3项中有项中有1项异常，按表项异常，按表可判定为沙门氏菌属可判定为沙门氏菌属如有2项项异常，为非沙门氏菌属异常，为非沙门氏菌属2）A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项实验结果均为阳性，但需要两项实验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果结合血清学鉴定结果进行判定进行判定3）A3：补做：补做ONPGONPG阴性阴性为沙门氏菌，同时为沙门氏菌，同时赖氨酸脱赖氨酸脱羧酶羧酶阳性，阳性，甲型副伤寒沙门氏菌甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性为赖氨酸脱羧酶阴性4）必要时进行沙门氏菌生化群的鉴别。

必要时进行沙门氏菌生化群的鉴别醇发酵试验阳性（黄）阳性（黄）阴性阴性邻硝基酚邻硝基酚半乳糖苷酶试验（半乳糖苷酶试验（ONPG试验）试验）5.5.血清学分型鉴定血清学分型鉴定 提供培养物菌种的鉴定提供培养物菌种的鉴定用分离出的沙门氏菌与已知用分离出的沙门氏菌与已知A-FA-F多价多价O O血清及血清及H H因子进行玻片凝集试验因子进行玻片凝集试验1 1）抗原的准备抗原的准备2 2）O O抗原的鉴定抗原的鉴定 用用AFAF多价多价O O血清做玻片凝集试验，以生理血清做玻片凝集试验，以生理盐水做对照盐水做对照3 3）H H抗原的鉴定抗原的鉴定 4 4）ViVi抗原的鉴定抗原的鉴定 第二节 金黄色葡萄球菌检验技术 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌近年来，美国疾病控制中心报告，近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌仅次于大肠杆菌金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占，加拿大则更多，占45%，我国每年，我国每年发生的此类中毒事件也非常多发生的此类中毒事件也非常多。

金黄色葡萄球菌的流行病学金黄色葡萄球菌的流行病学 金黄色葡萄球葡萄球菌 表皮葡萄球菌属分类：属分类：腐生葡萄球菌金黄色金黄色葡萄球菌食物中毒系葡萄球菌食物中毒系毒素型食物中毒是由于进食含毒素型食物中毒是由于进食含有一种或多种含葡萄球菌肠毒素有一种或多种含葡萄球菌肠毒素的食物所引起常见的菌为的食物所引起常见的菌为金黄金黄色葡萄球菌色葡萄球菌一、生物学特性n 革革兰兰氏氏阳阳性性需需氧氧或或兼兼性性厌厌氧氧菌菌，为为球球菌菌，排排列列成成葡葡萄萄状状，无无芽芽孢孢、鞭鞭毛毛，不不运运动动；大大多多数数无无荚膜n 最最适适生生长长温温度度3737，最最适适pHpH为为 7.47.4，对对 热热 抵抵 抗抗 力力 较较 强强，8030min8030min才能被杀死才能被杀死n 可可在在10%-15%10%-15%氯氯化化钠钠和和40%40%胆胆汁中生长汁中生长生物学特性生物学特性-培养特征培养特征大多数菌株产生类胡萝卜素，使细胞团呈现出深橙色到大多数菌株产生类胡萝卜素，使细胞团呈现出深橙色到浅黄色，色素的产生取决于生长的条件，而且在单个菌株中浅黄色，色素的产生取决于生长的条件，而且在单个菌株中可能也有变化可能也有变化可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。

甲可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气甲基红反应阳性，基红反应阳性，VP反应弱阳性反应弱阳性许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感素、红霉素等高度敏感致病性金黄色葡萄球菌是人金黄色葡萄球菌是人类类化脓感染化脓感染中最常见的病中最常见的病原菌，临床表现多种多样，原菌，临床表现多种多样，可引起局部化脓感染，也可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、可引起肺炎、胃肠炎、心胃肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染毒症等全身感染致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：a.a.溶血毒素：外毒素，分甲、乙、丙、丁、戊五种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引溶血毒素：外毒素，分甲、乙、丙、丁、戊五种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；起肌体局部缺血和坏死；b.b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；c.c.血浆凝固酶血浆凝固酶：侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，：侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。

阻碍吞噬细胞的吞噬作用葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关；葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关；d.d.脱氧核糖核酸酶：产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色脱氧核糖核酸酶：产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌；葡萄球菌；e.e.肠毒素：产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，肠毒素：产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，现已鉴定出葡萄球菌肠毒素现已鉴定出葡萄球菌肠毒素有有A、B、C1C3、D、E、G、H共共9种肠毒素种肠毒素A是最常见的是最常见的金黄色葡萄球菌的致病性金黄色葡萄球菌的致病性葡萄球菌皮肤感染二、检验所需培养基n10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤氯化钠胰酪胨大豆肉汤n7.5%氯化钠肉汤氯化钠肉汤n血琼脂平板血琼脂平板nBaird-Parker琼脂平板琼脂平板n脑心浸出液肉汤脑心浸出液肉汤(BHI)n兔血浆兔血浆n磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液n营养琼脂小斜面营养琼脂小斜面n革兰氏染色液革兰氏染色液n无菌生理盐水无菌生理盐水三、检验程序nGB4789.10-2010标准标准n第一法第一法适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验；适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验；n第二法第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数；色葡萄球菌的计数；n第三法第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。

高的食品中金黄色葡萄球菌的计数第一法第一法检样检样25g样品样品+225ml7.5%NaCl肉汤或肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤氯化钠胰酪胨大豆肉汤血平板血平板36124hr镜镜检检营养肉汤营养肉汤血浆凝固酶血浆凝固酶实验实验报告结果报告结果定性定性检测检测36124hr36124hr3616hrBP平板平板第一法第一法第二法第二法Baird-Parker平板法检验程序平板法检验程序定量检测定量检测定量检测定量检测（平板法）（平板法）（平板法）（平板法）适适用用于于检检测测金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌数数不不小小于于10/g（mL）的食品）的食品25g样品样品+225ml生理盐水生理盐水选三个连续梯度，每个梯度各取选三个连续梯度，每个梯度各取3mL加入加入3管胰酪胨大豆肉汤管胰酪胨大豆肉汤36145-48hrBP平板平板血浆凝固酶血浆凝固酶实验实验查查MPN表表定量定量检测检测（MPNMPN法）法）法）法）36145-48h报告结果报告结果适用于检测可能含适用于检测可能含有有少量少量金黄色葡萄金黄色葡萄球菌，却带有球菌，却带有大量大量竞争菌竞争菌的样品的样品梯度稀释梯度稀释第三法第三法金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌MPN检验程序检验程序金黄色葡萄球菌的检测金黄色葡萄球菌的检测测定方法测定方法国标方法注意事项国标方法注意事项现象观察：染色镜检（形态、现象观察：染色镜检（形态、染色染色）表面光滑的菌落，菌落色素不稳定，但多数为金黄色。

表面光滑的菌落，菌落色素不稳。