分子机制实验方法总结写作套路：核酸检测篇5-RACE技术.docx

编号：2-5主题：RACE技术概述：近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多克隆新基因的方法和手段，cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE）是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5和3末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视目的：1.可用于cDNA文库的构建及筛选2.应用RACE克隆已知片段的旁侧内部序列3.RACE可用于克隆同源基因的同源片段，为寻找同源基因提供了一种手段4.RACE技术与生物信息学,例如EST库相结合,具有快速,高效克隆新基因的特点原理：RACE是采用PCR技术由已知的部分cDNA顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端，是一种简便而有效的方法, 包括单边PCR和锚定PCR操作步骤：1、3’RACE-PCR3’-RACE的步骤是:利用mRNA的3’末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核营酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA然后用一个基因特异引物GSP1(gene specific primer, GSP)作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer ,UPM)作为下游引物，以cDNA第一链为模板,进行PCR循环，把目的基因3’末端的DNA片段扩增出来。

2、5’RACE-PCR5‘-RACE的步骤是先利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5‘末端时自动加上3-5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer, UPM)作为上游引物，用一个基因特异引物2(GSP 2 gene specific primer, GSP)作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5‘末端的cDNA片段扩增出来最终，从2个有相互重叠序列的3 / 5‘-RACE产物中获得全长cDNA，或者通过分析RACE产物的3‘和5‘端序列，合成相应引物扩增出全长cDNA。