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酪氨酸激酶受体Eph亚族探究进展摘要：酪氨酸激酶受体(RTK)参与细胞生长、分 化、胚胎发育及细胞内信号传递等过程，具有相当重要的生 理功能，发现50多种RTK基因属于14种亚簇，Eph亚族是 其中最大的家族，由14具基因组成，一些基因主要在脑的 发育中表达，另一些在各种组织中广泛表达，最近亚族胞外 配体的发现为深入其生理功能打下基础，综述了 Eph亚族成 员的来源、表达及其配体的研究概况从细胞表面到细胞核的信号转途径是人们十分关心 并不断探索的热点具有酪氨酸激酶活性的受体(receptor tyrosine kinases,RTKs)是外界刺激信息传递至细胞核， 转化成细胞效应的信号通路的关键组成，参与细胞生长、增 殖、转化及胚胎发育和肿瘤形成，具有重要的生理功能［1］ 所有RTKs都是膜结合的I型糖蛋白，其结构的共同特点是 整个分子可分成三个结构区，即胞外的配体结合区，细胞内 部具有酪氨酸激酶活性的功能区和连接这两个区域的由疏 水氨基酸组成的跨膜区，配体结合PTK胞外区域后使其构象 发生变化引起受体在包膜上迁移、聚集，并形成寡聚化的受 体-配体复合物，激活胞浆的酪氨酸激酶而活化，导致自身 磷酸化及下游胞内底物蛋白质分子的酪氨酸磷酸化，启动不 同信号途径将信号逐级传递［2］。

RTKs研究速度非常快，按其独特的结构特点，序列同 源性及配体性质分类，就目前的报告统计至少已发现有50 多个RTK基因分属于14个不同亚族，Eph是其中成员最多的 家族，约有14个基因组成 毕业论文1 Eph亚族受体的的结构与分类Eph亚族明显的结构特点［3］是它们的胞外配体结合 区含一个免疫球蛋白样重复序列，一个半胱氨酸富含区（有 20个胱氨酸残基），后面有两个FNIII （纤粘蛋白III型）重复 区；在胞浆酷氨酶区无激酶插入（KI）的序列阻断，由于核 区氨基酸序列尤其在各受体亚族中高度保守，对这部分序列 按氨基酸同源性的高低做为建立种系发生树（phylogenetic tree）的依据，从中可以得出各亚族成员关系（图1） ［4］ 同源性基因间序列同一性大于88%的归于一种，从而将已克 隆的40多个基因归于14种，尽管Eph亚族在结构上高度保 守，但各成员同源性，表达分布与结合配体各不相同，据此 又可将其分成EphA和EphB subgroup.这几年来对Eph亚族 的研究蓬勃发展，突出成就在于不断发现和克隆新的成员及 配体，证实Eph亚族的基因区域化表达与神经轴突束的组织 趋化性发育途径有对应关系，从而与脑区的形态结构以及神 经结构的形成密切相关。

Eph亚族的命名［6］源自该亚族最早的成员Eph （新命 名EphAl）,是Hirai用非严谨杂交技术以vfps的酪氨酸激 区序列为探针从人杆细胞癌细胞株cDNA文库中克隆［3］ oEph 基因在进化上高度保守，用人Eph cDNA探针可从大鼠、鸡、 小腹果蝇中检测到特异DNA带，人Eph基因定位于7号染色 体，编码3. 5kb Mrna.RNA印迹分析表达在大鼠肝、肺、肾 有Mrna水平高表达，在小肠表达较低，在几种人肿瘤中（肺 癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、结肠癌），Eph表达高于相应正 常组织，但无基因扩增，且高表达的Eph基因体外使NIH3T3 诱发裸鼠致瘤及能在软琼脂上形成克隆［4］提示Eph高表 达也许与肿瘤发生有关毕业论文1. 2 Elk（eph-like-kinase）Elk （新命名EphBl）是该亚族第二个成员，是用抗磷 酸酪氨酸抗体从大鼠的脑cDNA文库中克隆［7］,它的表达与 eph不同，仅大鼠脑中检测到ElkmRNA,在小肠中表达较少, Iwase［8］通过RNA印迹分析表明Elk在14至16d大鼠胚胎 胃中表达高，至18d及新生鼠中表达非常低，在成年鼠胃中 没有检测到Elk表达，在3例人胃癌组织中发现有2例Elk 的mRNA表达水平几倍高于正常胃组织，推测Elk也许在人 胃癌中起一定作用。

1. 3 Eck（epithelial-cell-kinase）Eck (新命名EphA2)是该亚族第三个发现并克隆全长 cDNA的成员，来源于人角化细胞cDNA文库，并由此得名， 它广泛表达与上皮来源细胞中[9],其4. 7kbmRNA在大鼠肺、 皮肤、小肠和卵巢及上皮性细胞系高表达，在肾、脑，脾等 有低水平表达，eck是该亚族成员被发现有酪氨酸激酶活性 的第一个基因，用免疫沉淀以抗Trp e融合蛋白(含Eck C 端101氨基酸)，并将免疫复合物进行体外激酶实验，对磷 酸化蛋白进行磷酸氨基酸分析，确证了其磷酸化主要是在酪 氨酸上1. 4 Heks (human ephT ike-kinases)Heks( Hek4,5,7,8,ll) [10]是从人胚脑 cDNA 文库 中用PCR和5 RACE方法克隆出来的一组基因，采用的是根 据该亚族高度保守的胞内催化功能域WTAPEAI和VCKVSDFG 基序而设计合成，氨基酸同源性分析表明hek4 (新命名 EphA3 )与cek4 (99%)和mek4 (98%)同源性最高，即它们的同 源基因，编码983个氨基酸，有典型的ATP结合位点 (GXGXXG),其779位Tyr为自身磷酸位点，主要在人胎盘、 心、脑、肺、肝组织中表达，还在两株T白血病细胞株(JM, HSB-21)和一株前B细胞株中表达，另外在1/28慢性淋巴 细胞白血病及2/39急性髓细胞白血病表达，表明它在正常 淋巴系统的功能和分化中及一些人恶淋巴肿瘤中有一定作 用。

毕业论文Hek5(新命名EphB2)即以前命名的Erk(Elk-relatedkinase) 基 因 [11], 与 ERK 蛋白 (extracellular signal-regulated kinases)是不同的，后者在 MAPK 级联 中可被MEK磷酸化，Iwase胞内激酶区的片段，通过RNA印 迹分析表明Erk在鼠中表达降低，而成年鼠的胃的中已检测 不到该基因表达，而且首次在人胃癌组织中检测到Erk表达 显著高于相应正常组织，故而认为Erk 了也许在胃的胚胎及 肿瘤发生中起一定作用随后Kiyodawa等［12］的研究更证 实了这点，他们用此cDNA片段做探针克隆出全长Hek5序列, 与其他Eph亚族基因氨基酸序列比较，在氨基端有一个不完全信号肽区，与Cek5(92. 5%) ,Nuk(91. 1%)同源性最高Hek5主要在上皮来源的组织(甲状腺，结肠等)及肿瘤细胞系( 癌、食道癌、结肠癌等)表达，另外在非上皮来源的骨肉瘤 细胞系Huo-3NI有表达，在各种肿瘤组织中的表达均几倍高 于相应正常组织，其中胃癌显著75%高表达，未发现扩增及 重排Hek5 的鸡同源物 cek5 (chicken embryo kinase)是从 10天龄鸡胚cDNA表达文库中用抗磷酸酪氨酸抗筛选出来， 蛋白质印迹表明Cek5在鸡胚脑中高表达，在肾、肺、肠等 低表达，另外，同时还得到了一个Cke5异型体(Variant) Cek5+的部分序列，发现它在膜并列区域多了 16个氨基酸的 插段，也许是选择剪切(alternative splicing)不同的结 果，并且这是神经系统特有的，与此类似，CeklO(新命名 EphB3)也有异型体CeklO+,在膜并列区域有15个氨基酸的插 段[13],目前对这种现象还所知甚少。

毕业论文1. 5其他新基因Tck, (tail and cement gland kinase),XElk,P17a[14] 是从非洲蟾蛛克隆出来，分别与Hek2 (79%)、Elk(91%). Myk-1(80%)同源性最高，XElk是Elk的蟾同属同源物,Tck xElk均在卵母细胞成熟过程中有不同程度表达，故推测在特 定组织胚胎发育的信号传导中起一定作用2 Eph亚族受体的配体研究阐明Eph亚族各成员的生理功能及研究信号转导途径 的第一步依赖于配体的分离，目前已分离出8种不同的配体 分为 ephrin-A 和 ephrin-B subclass (Eph family receptor interacting proteins). ephrin-A(Al~A5)类配体靠糖基磷 脂酰肌醇链(GP1-1 inkage)锚定在细胞膜上，PI-PLC能水 解GPI ,使其从细胞表面释放下来具备可溶性；ep hrin-B(B1〜B3)类配体是跨膜蛋白，结合研究表明该亚族已 发现的配体可与多个受体以不同的亲和力交叉结合且发挥 不同的作用[15] o配体在组织中的表达广泛，其结构可分为 四个区即信号区、结合区、spacer区、疏水区、胞外区有四 个保守的半胱氨酸残基和一个推测为糖基化的位点，及受体 的结合位点，结合区有9个P -extended构象，也许存在类 似Ig折叠的3 -sheets构成的二级结构，疏水区有信号通 过GPI连接或跨膜形式将蛋白锚定于膜上，Spacer区使受体 结合区从质膜伸展开。

二级结构分析表明这些配体不属于已 知的结构基序，与其结构相似最高的大多为T细胞受体或Ig 序列[16] o配体与受体的结合能导致受体自身磷酸化和与细 胞中信号蛋白分子的作用毕业论文B61 （新命名ephrin-Al）是该亚族第一个发现的配体, 早先是从IL-1或TNF诱导的人脐静脉内皮细胞中克隆的立 早反应基因，存在可溶和以GPI锚固定于膜上二种形式，研 究发现后者是Eck配体可结合并激活Eck,原位杂交分析表 达B61和Eck均在肺和内脏高表达，B61基因位于小鼠3号 染色体[17] o随后又证实它与另一个新发现的配体LERK2（新 命名ephrin-Bl） 一起能与Elk和hek结合[18] o对配体的 研究发展也非常迅速，越来越多的配体被发现，park用非 严谨PCR克隆技术来克隆B61的同源基因，结果从鼠脑中分 离出3 个不同的配体 Elf-l/cek7-L（新命名 ephrin~A2）, Ehkl-L/Ef 1~2/Lerk3 （新命名 ephrin-A3 ）和 AL-1/RAGS （新命名 ephrin-A5）可激活 Eek[15]o随着越来越多配体的发现对功能的研究得以深入开 展，Ciossek发现Elf-1和B61两种配体与MDK1结合能导致 其自身磷酸化和Rati细胞中一个未知的内源62ku蛋白质酪 氨酸磷酸化，这也许表明MDK1及其配体在鼠早期发育中起 作用［19］。

双杂交系统证明在P19胚癌细胞株中,EphBl (ELK) 被其配体ephrin-Bl/Fc活化后可与胞内接头蛋白Nek的SH2 结构域结合，进一步激活c-Jun激酶(JNK/SAPK),而瞬时 高表达突变的EphBl受体(Y594F)则阻断了 EphBl到JNK 的信号传递，从而证明了 Nek是介导EphBl到JNK信号通路 的重要连接分子［20］鉴定所有配体及阐明它们的功能是今 后面临的挑战性任务毕业论文Eph是一大类新发现的RTK,分子生物学技术的发展 使Eph亚族迅速壮大成为RTK最大的家族，昨天其广泛的种 属和组织分布，结构上的高度保守，提示它们在细胞内具有 重要的生理功能，尽管有研究表明，Eph亚族参与神经系统 的细胞间相互作用及轴突发育路径，Eph、Hek、Erk、Elk等 与人肿瘤有关，但Eph亚族的研究尚处于资料和认识的积累 阶段，即仍需大量研究加以证实克隆Eph亚族新基因及继 续寻找胞内各成员的天然配体及特异底物范围及生理功能， 为最终阐明它的信号传导机制及生长调控、神经系统发育、 肿瘤发生的关系提供满意答案Yarden Y,Ullrich A,Growht factor receptor tyrosinekinases,Annu Rev Biochem,1988；57:443-478Ullrich A,Schlessinger J. Signal transduct。