《论文_TLR9表达与胃癌临床病理特征关系的初步研究(定稿)》.doc

TLR9表达与胃癌临床病理特征关系的初步研究作者:马亚军1,张艳丽1,崔柳1,李秀萍2作者单位：1.宁夏医科大学;2.宁夏医科大学总医 院【摘要】目的观察TLR9在胃癌中的表达及其与胃癌临床病理特征的关系方法 运用 Western-blot方法测定円癌细胞系MGC803 TLR9的表达;川不同浓度的TLR9激动剂CpG 0DN(2、5、10g?mL-l)分别作用于胃癌细胞系MGC803不同时间(24、48、72h)后,用四甲 基偶氮呻盐微量晦反应比色法(MTT法)检测细胞牛氏抑制率;免疫组化SP法检测30例冒癌 纽织和15例癌旁纽织中TLR9的表达，并分析其与患者临床病理特征的关系结果 Western-blot法检测到TLR9在胃癌细胞系MGC8O3中有表达;2 g?mL-l和5 g?mL-l CpG 0DN仅在作用的72h有抑制胃癌细胞增殖的作用(P0.0I),而10 g?mL-l CpG ODN作用24、 48h和72h均能显著抑制该细胞的增殖(P 0.01);免疫组化结果显示，在胃癌组织和癌旁组织 中均有TLR9的表达，H癌旁组织TLR9的表达高于胃癌组织(P ().05);高、中分化组TLR9 的衣达高于低分化纟IKP0.05);未观察到TLR9蛋白的表达与患者的性別、年龄、肿瘤大小、 部位、TNM分期和淋巴结转移具有相关性。

结论TLR9在胃癌中有表达，H与肿瘤分化程 度有关关键词】CpGODN;TLR9;胃癌胃癌具有发牛率高、侵袭性强的特点，胃癌细胞的牛物学行为与临床病理变化有一定的 关系，但其中涉及的分子机制仍不清楚［1］Toll样受体(Toll・like receptors, TLRs)在识别病 证实,TLRs在肿瘤发生、发展过程中既可能促进肿瘤生长也可能发生抗肿瘤效应，并口 TLRs 的表达与肿瘤的某些临床病理特征有相关性，如淋巴转移、肿瘤分期、分化程度等TLR9 是否参与胃癌发生发展过程，目前尚不清楚木研究以胃癌细胞系MGC8O3、胃癌纽织及癌 旁组织为研究对象，观察TLR9在胃癌的表达情况及其与胃癌临床病理特征的相关性1材料和方法1」材料MGC803细胞为本室保存;RPMI1640培养基购口 GBICO公司;四甲基偶氮岬盐(MTT)购自 Amresco公司;胎牛血清购自民海生物公司;TLR9激动剂CpG ODN 1826(5,-tcc atg acg ttc ctg acg tt-3?,全程硫代修饰)山北京赛百盛生物基因技术有限公司合成;胃癌组织和癌旁组织均 由宁夏医科大学总医院病理科提供;TLR9抗体购口 abeam公司;SP试剂盒购口北京中杉金桥 生物技术有限公司。

1.2方法1.2.1 Western-blot方法测定胃癌细胞系MGC803 TLR9的表达培养细胞达到80%〜90%以上的融合状态吋，改用含2%胎牛血清的RPMI1640培养提 取肿瘤细胞总蛋白行BCA定量，取40 g上样,SDS-PAGE电泳分离蛋白，PVDF膜在 60V,300mA,4 C恒流条件下转膜3 h,5%脱脂奶粉4 C封闭过夜，TBST洗3次，鼠抗人 TLR9单克隆抗体1 ： 100的工作浓度下37 C孵育3h, TBST洗3次后用羊抗鼠二抗1 ： 100工作浓度下37 C孵育2h后仍用TBST洗涤，DAB显色，ECL发光及曝光，将胶片 进行拍照1.2.2 MTT法检测细胞增殖活性按常规方法用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液,在37C、5%CO2饱和湿度的孵箱中对胃癌细胞MGC8O3进行培养选取处于对数牛长期且细胞活性大于98 %的细胞进行 实验调整细胞浓度为2 107/L加入96孔培养板实验分为四组，细胞对照组;加药组①：2 g?mL-l 的 CpG ODN 组;加药组②：5 g?mL-I 的 CpG ODN 组;加药组③：10 g?mL-l 的 CpG ODN组，每组各设3个复孔。

分别作用24、48 h和72 h后，终止培养，每孔加入终浓度5 g?mL-l的MTT 10 L,37C孵育3h后，在酶标仪上测定450 nm波长卜各孔A值1.2.3免疫组化SP法检测胃癌组织和癌旁组织TLR9的表达操作严格按SP试剂盒说明书进行结杲判断：TLR9以细胞浆和(或)细胞膜呈棕黄色或 棕褐色为阳性400倍光镜下每张切片随机取10个高倍视野阳性细胞百分率，授后取两位 病理学专家计算白分率的平均值以TLR9表达阳性细胞率10%为阳性(+), 75%为强阳性 (++), 10%为阴性(・)1.3统计学方法全部数据采用SPSS 11.5处理，计数资料以百分率表示，采用2检验或Fisher确切概率 法;计量资料的组间比较采用t检验，P0.05为差异有统计学意义2结果2」TLR9在胃癌细胞MGC803的表达Western-blot法测定结果显示胃癌细胞MGC8O3中有TLR9的表达，见图1图1Western-blot法检测TLR9的衣达2.2 CpG ODN对MGC 803细胞生长的抑制作川2 g?mL-l和5 g?mL-1 CpG ODN仅在作用的72 h有抑制MGC803细胞增殖的作用;而10 g?mL-l CpG ODN在作用MGC803细胞24、48h和72h均能显著抑制该细胞的生长，差异 有统计学意义(P0.0I),见表1。

表I CpG ODN对MGC803细胞增殖活性的影响2.3 TLR9在胃癌组织和癌旁组织的表达TLR9在胃癌组织和癌旁组织中均有表达，胃癌组织TLR9表达阳性率明显低于癌旁组织 (P 0.05),见图2(封2)和表2在临床病理特征方面，年龄60岁12例，60岁18例;男16 例,女14例;贲门、胃大弯侧12例，胃窦、胃小弯18例;肿瘤5cm 17例，5cm 13例;有转 移19例，无转移11例;TNM分期I〜II期11例，111〜IV期19例TLR9表达阳性率依次 为 50%(6/12)、27.8%(5/18);43.8%(7/16)、2&7%(4/14);50%(6/12)、27.8%(5/18);29.4%(5/17)、 46.2%(6/13);31.6%(6/19)、45.5%(5/11);54.5%(6/11)、26.3%(5/19),以上结果差异均无统计学 意义(P0.05)o而在胃癌的分化程度中,高、中分化20例TLR9表达阳性率50%( 10/20),低 分化10例表达阳性率10%(1/10),差异有统计学意义(P0.05)o表2TLR9在胃癌组织和癌旁 免疫组化结果3讨论在前期研究中，用RT-PCR法检测出胃癌细胞MGC803中有TLR9 mRNA的表达，其激 动剂CpG ODN对胃癌细胞的生长具有抑制作用⑵。

木次试验用Western-blot法同样检测出 MGC8O3中有TLR9蛋白的表达，并J4发现CpG ODN作川MGC8O3细胞72 h对其增殖活 性的抑制作用呈浓度依赖性对胃癌组织和癌旁组织行免疫组化检测发现，TLR9在胃癌组 织和癌旁组织中均有表达在胃癌组织中，高、中分化组的阳性表达率明显高于低分化组 且随着胃癌分化程度的增髙，TLR9的阳性表达率及表达强度均升高，提示TLR9表达降低 者，其恶性程度高，这対辅助判定肿瘤的恶性度有一定价值在某些肿瘤中已有类似发现, Schmausser等人在正常胃黏膜上皮中检测到TLR9的表达，但在癌前病变包括胃黏膜肠上皮 化牛和胃异型增牛中TLR9的表达缺如［3］根据TLR9的激动剂CpG ODN对胃癌细胞的生长具有抑制作用，可以考虑将CpG ODN 作为靶向药物川丁胃癌患者的免疫治疗或辅助治疗，这一点还需在动物实验中进一步验证, 其具体的抗肿瘤机制也需要进一步明确目前，TLR9及其激动剂应用的研究在一些肿瘤中 已进入抗肿瘤临床试验阶段[4],如乳腺癌、非小细胞肺癌、非第奇金淋巴瘤、基底细胞癌 等肿瘤是多种因素导致的疾病，TLRs是固有免疫模式识別的主要受体，通过对PAMPs进 行模式识别，经一系列信号传导分子最终导致NF-B等核因子的激活，调节与免疫有关的 基因表达，产生多种细胞因子及刺激DC的成熟，发挥抗肿瘤作用。

另一方而，TLRs/ NF- B通路也可能参与肿瘤的发牛、发展根据本研究结杲初步推测，TLR9的表达在胃癌的发 生发展中起作用，与相应配体(CpG ODN)结合后可产生抗肿瘤效应，有望用于临床诊断、胃 癌患者的单一治疗或者临床辅助治疗，这不仅使患者获益更大，也有利于肿瘤免疫治疗研究 的开展，具体机制将在后续研究中继续 20801865。