核酸定量与光吸收值
4页1、260/280;260/230 &核酸定量核酸在波长 260 nm处有最高吸收峰。吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的,所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质,不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性。但紫外法不能区分DNA和RNA,只能用来鉴定核酸的纯度和含量。 蛋白质由于含有芳香氨基酸,因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处,在260nm处的吸收值公为核酸的十分之一或更低,故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。 RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上;DNA的260nm与280nm吸收的比值则在1.9左右。当样品中蛋白质含量较高时比值即下降。 核酸的定量 DNA和RNA都有吸收紫外光的性质,它们的吸收高峰在260nm波长处,每种核酸的分子构成不一, 因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸,事先要选择对应的系数。如:1OD 的吸光值分别相当于50g / ml 的dsDNA,37g / ml 的ssDNA, 40g/ml的RNA,30g/ml的寡核苷酸。测试后的吸光值经过上述系数的换算,从而得出相应的样品浓度,这些由
2、分光光度计内预设的程序执行,因此,测试前选择正确的程序,测试样品的类型,首先测试空白液,然后再测试样品,注意输入样品稀释倍数。 如何避免吸光值漂移 读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器, 表现出的吸光值漂移越大。事实上,分光光度计的设计原理和工作原理,允许吸光值在一定范围内变化,即仪器有一定的准确度和精确度。 核酸本身物化性质 溶解核酸的缓冲液的pH 值、离子浓度等 在测试时,离子浓度太高也会导致读数漂移,因此建议使用pH 值一定、离子浓度较低的缓冲液(如TE)可大大稳定读数。核酸的吸光值受pH值和缓冲液离子浓度影响。只有在一定的pH值和低离子浓度的条件下(如10 mM Tris-HCl pH 8.0),才能得到精确的检测结果。水的pH值不稳定,可能导致检测误差。一些缓冲液在紫外范围内存在自身吸收,为了确保准确测量,请使用与悬浮或洗脱样品时相同的缓冲液。 样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素,由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒,尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响,要求核酸吸光值至少大于0.1A ,吸光值最好在0.1-1.5
3、 A。在此范围内,颗粒的干扰相对较小,结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低,或者过高(超过光度计的测试范围)。 操作因素 如混合要充分,否则吸光值太低, 甚至出现负值;混合液不能存在气泡,空白液无悬浮物,否则读数漂移剧烈;必须使用相同的比色杯测试空白液和样品,否则浓度差异太大;换算系数和样品浓度单位选择一致;不能采用窗口磨损的比色杯;样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。各波长具体含义及相关问题1. A260nm 是核酸最高吸收峰的吸收波长,最佳测量值的范围为0.1至1.0。如果不在此范围,稀释或浓缩样品,使之在此范围内;如果吸光度小于0.05,检查是否存在操作因素(如移液不准确,样品内有悬浮物等)影响。DNA样品的A260 吸光度值是否0.1。(请注意,这个值跟仪器无关,核酸的吸光度必需大于0.1,其值才有效和可靠,因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收,其值2。也就是说,如果RNA样品的260/280=2,260/2301,那么污染原因就应该考虑是胍盐残留。 其他: 用分光光度计测量RNA时,用水而不是用TE 缓冲液稀释RNA样品会造成A260/A280比值下降。原因是低离子强度和低pH溶液会增加280 nm处的光吸收值。 氯仿离心后取上清的时候千万不要贪多 ,那样就很容易被蛋白污染,所以现在一般取400ul左右。 当260/2301时,只有两种情况。一是胍盐污染,二是蛋白污染。
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