板种细胞问题(不均匀)

1、细胞不均匀的问题细胞不均匀的问题 原因原因： 1.培养液量少培养液量少，由于瓶体内液体有向边缘吸的特性，所以造成中间低洼，细 胞容易聚集，建议多加液体 2.接种后不要摇晃接种后不要摇晃，传统的思想认为摇一摇能使细胞均匀，但是事实上在摇晃的 时候由于剪应力等多种因素的影响，细胞反而分布不均。 解决方案：解决方案： 1) 接种到培养瓶的细胞，轻轻地让细胞悬液流遍整个瓶底； 2) 接种到培养皿或者培养板的细胞，用枪头对准中央加，让细胞悬液自行 流遍整个孔，若有少量区域未能覆盖到细胞悬液，可用枪头轻轻牵引悬液，千 万不要摇。细胞悬液铺满后，不宜立刻放入孵箱中，我一般静置 用枪头对准中央加，让细胞悬液自行 流遍整个孔，若有少量区域未能覆盖到细胞悬液，可用枪头轻轻牵引悬液，千 万不要摇。细胞悬液铺满后，不宜立刻放入孵箱中，我一般静置15min，这样 接种的细胞很均匀。 3) 培养皿 划 “十” 字交叉轻轻混匀 （力度不易太大， 否则剪切力损伤细胞） ， 重复一次。 轻轻放入孵箱即可。 （1）平底和圆底（U 型和 V 型）培养板的区别和选择： 贴壁细胞一般用平底培养板。悬浮型细胞的培养一般用 V 型

2、。 U 型培养板亦多用于培养悬浮型细胞 。V 型培养板有时用做免疫学血凝集的实 验。 （2）细胞培养常见问题与解答 问：我看到培养板有 4、6、12、24、48、96 孔几种规格 ，但不知道到底什么实 验用哪种规格。 答：要根据你具体的实验要求，流式一般用 6 孔，MTT 一般用 96 孔，细胞爬片 一般用 24 孔等，要具体根据你实验来定。 问：我想测吸光度用酶标仪，用多孔细胞培养板行吗？请问酶标板 多孔细胞培 养板有什么区别？ 答：用多孔细胞培养板测吸光度肯定可以拉，我们经常用它来做样品的蛋白定量 和 MTT 检测。 区别：酶标板一般要比细胞培养板贵，细胞板主要做细胞培养，但也可以用来测 蛋白浓度；酶标板包括包被板和反应板，一般不能用做细胞培养，它主要做免疫 酶联反应后的蛋白检测，它需要更高的要求还需要特定的酶标工作液。常用不同 培养板的孔底面积及推荐加液量：不同孔板所加培养液的液面都不宜太深，一般 在 一般 在 2-3mm 范围范围，结合不同孔的底面积就可算出各培养孔的适宜加液量。若加液 量过多会影响气体（氧气）交换，而且在搬动过程中易溢出造成污染。具体所加 细胞密度依实验的目的

3、不同灵活掌握。 （3）细胞培养板的密闭和污染问题 问：96，24 孔培养板或培养皿的盖子都很松，这样是方便了透气，但是细菌、 霉菌等污染物会不会也随着溜进去呢？ 答：1.盖子很松，属于半开放培养，这样的目的是透气（实际上是为了使培养皿 外的 co2 能够与培养皿充分交换，维持培养基的 pH 值） 。 2.凡事有利必有弊，这样当然增加了污染的可能性。此外这样还会使培养皿内的 液体蒸发，这对于精确定量的药物来说就显得值得注意了。所以以下二条措施是 必须的 a 培养箱内空气必须清洁（定期紫外线照，酒精擦洗，尽量少开关培养箱） b 培养箱内的湿度必须始终保持为 100%（培养箱内放置无菌蒸馏水的水槽） 。 就好像培养皿，也是一个盖倒扣的容器，也不会污染。主要是因为盖子“L”型 边缘产生气流负压的缘故，灰尘上面才附着有微生物，而气流携带的灰尘是无法 通过产生负压的盖边缘的。而透气作用只是通过空气的扩散，不会产生气流，所 以只会透气不会透菌。 问：我使用 24 孔板，在其中的某些孔中有操作（在超净台内） ，而其它孔中还有 细胞要培养.我很担心这样会污染，不知道要注意什么? 在超净台内如果操作规范的

4、话应该可以的，我想你可以充分利用培养版的盖子， 尽量只暴露要操作的孔，将其它孔用盖子盖起来。这是我的一点粗浅的见解，抛 砖引玉吧！ 使用前综合考虑一下，充分使用所以的孔；如果只需要使用少数的孔可以只用一 边的，其余用盖子盖住，我习惯于先用右侧的孔（右手加样方便） 。 其实自己感觉只要注意无菌操作，一般是不会污染的。操作时用几块玻片把板子 一侧垫高，不要把盖子全打开，一般没问题。 （4）细胞分布不均及解决办法 问：我的细胞接种培养板，细胞总是聚集在周边部分，该如何处理啊？我看园子 里有的战友的细胞却是聚集在中间，是不是板子的质量问题啊？ 答：请问你的细胞是如何混匀的？是滴管吹打还是振荡培养板？如果是后者，而 且是转圈摇匀转圈摇匀的话， 很有可能由于离心力的作用使细胞甩到周边部分， 导致细胞 中间少，四周多！自己可是试试！ 周边一般是相对会多一点，但是中间的数量也不会很少啊 铺板的时候我也没 有特异去振荡培养板。 大概是板子的质量问题吧或者是不是铺板时候的细胞密度太低了？我用的 corning 的板 。 一个好办法：在你培养种板之前，把培养板放入培养箱里进行几个小时的饱和 后再取出，种入细

5、胞时力量要轻，可采取用滴头在培养板孔的侧面慢慢加入让 细胞悬液流入板孔中，培养的细胞基本是均匀生长。记住千万不要用振荡器振 荡，否则你的细胞就会想你说得那样聚积在一起。 在你培养种板之前，把培养板放入培养箱里进行几个小时的饱和 后再取出，种入细胞时力量要轻，可采取用滴头在培养板孔的侧面慢慢加入让 细胞悬液流入板孔中，培养的细胞基本是均匀生长。记住千万不要用振荡器振 荡，否则你的细胞就会想你说得那样聚积在一起。 我今天把培养板放入培养箱里几个小时，适当的把细胞密度加大了一下，另外多 加了一点培养液， 今晚看细胞铺的挺好的。 我认为有两种可能解决你问题的办法: 1.加入前吹打均匀;2.从多孔板侧边或底边缓慢加入。 问：我在做原代培养时也遇到过这种情况，我一直以为培养皿铺胶不均匀会导致 这种现象，因为混匀的血管段加入到培养皿中时，在相差显微镜下血管段均匀分 布在培养皿中，24h 后贴壁的血管段就是周边多，中间相对少些。下次我要试试 hkqu 战友的方法看能否改变这种现象。 答： 这种现象很正常呀， 不知你仔细观察过没有， 孔直径愈小， 这个现象越明显， 我试过，24、96 孔板这种现象不可避

6、免，因为液体的附壁使得孔内培养液不是 成一个液平面，而是周边高，就像凹镜一样，而使用这两种孔板由于需要加干预 等原因而不能加足量培养液，使得细胞随培养液一起出现“边集”现象，如果为 了使孔中央也有均匀细胞而增加接种细胞数量的话，这要看你需要观察何种指 标，如果是 MTT，免疫组化的话会因为细胞成层而影响结果。 （5）6 孔板接种和换液问题： 问：我的细胞传代很正常，但一种到六孔板里（不管加药和对照） ，总有两三个 孔（随机）细胞长得不好，很小，像破碎了。有人遇到过这种情况吗？到底是啥 原因呢？请各位指点 答：可能跟你加液的温度有关。如果你细胞刚刚拿出来换液加液，培养基也是从 4 度冰箱拿出来不久，很容易细胞就会冻死了。建议你最好把培养基先在培养箱 里边孵育 15min 先。 另外， 跟你细胞的生长状态也有关。 加药之前的细胞可以用高点的血清浓度培养。 保证细胞状态良好。 或者放在 37 度水浴锅里孵育也可以，或者是培养板本身的问题，你再换换其它 培养板试试看。再有可能就是细胞状态问题了，种板时的血清浓度调高试一下 问：最近几天，我用六孔培养板接种细胞，培养 24 小时后更换培养基，在更

7、换 培养基之前，显微镜观察到细胞贴壁，状态非常的好，更换了培养基后，立即用 显微镜观察，发现每个孔中都近乎有一半的细胞表现出近乎死亡的状态。细胞变 得非常小，产生大量的碎片，而另一半的细胞一切正常，异常细胞与正常细胞之 间存在一条分水岭，上半个圆是好的，下半个圆就不好，这是怎么一回事？ 答：你可以看一下是不是培养板没放水平。有一回我也出现过这种情况。 你的培养液如何，如果培养液过期，细胞就不会贴壁。换一点新配制的培养液试 一试。我也经常碰到，我想可能是板的问题，换一个牌子的板或换用培养瓶就没 问题了。不知楼主所需换液的培养板多不多，换培养基的时候如果没有注意风机 的影响，特别是所需换液的培养板很多时，容易使细胞因风吹失水而干缩破裂。 如果如此，换液时应该逐个培养板进行，别怕浪费吸管，注意操作的效率！ （6）24 孔板接种问题： 问：把细胞消化接种到 24 孔板之后，已经四天了，老是每孔的中间部分长不满， 每天换液时都用 PBS 清洗，第二天换液时都出现同样的情况，每孔的边缘长的 很好，中央大量死细胞？ 答：我是选择孔内铺盖玻片，在玻片上种植。每次换液都用 PBS 洗，必要的步 骤吗？另

8、外，也有可能和细胞种类有关或者和培养液有关？ 我想你的培养液可能加的太少了。由于表面张力的作用，培养板的边缘液体会向 上走，造成培养液面呈现一个凹面（就像量筒的液体凹面一样） ，中央的细胞正 好在凹面的最低处，培养液少，细胞的营养不够，甚至干涸掉，空气中的氧气也 会造成损伤，即使有增值过来的细胞也会死掉。 另外，检查一下培养箱底部的水是否少了，如果少了，箱内的空气湿度不够，会 造成培养液挥发加快，这样即使刚加的液体不少，过一段时间，由于蒸发，液体 量会减少，造成中央干涸。并且这样会改变了培养液的成分浓度，造成渗透压过 高。 个人经验认为这是物理问题:24 孔板小，细胞接种进去后是很难摇均匀的，结果 导致细胞重贴壁后呈现四周密中间稀的状况.至于中间较多死细胞，如果是悬浮 状的话，也一样是物理问题。接种后比较粗暴的碰撞，似乎对摇均匀细胞有一定 效果. 在为多孔板培养的细胞换液时一定要注意，不要把培养基吸得太干，如果完全吸 取，很容易造成细胞干涸，这样的话细胞会很快死亡。我有一段时间总是遇到这 个问题，一个板子中总有一两个孔出现细胞大量死亡，后来发现是上面的原因。 现在我做的时候如果必须把液

9、体吸干，我会一个一个空来吸取，最多一次不超过 3 孔，然后马上加入液体，同时在作转染时，我会在吸液和加液时将风机关掉， 这样基本上会避免细胞死亡 同时在作转染时，我会在吸液和加液时将风机关掉， 这样基本上会避免细胞死亡。 同时你所说的细胞周围密而中间稀疏，大约有如下原因： 1.培养液加得太少。主要是由于液体张力的问题。 2.细胞接种后震荡太厉害了。由于离心力作用导致细胞分布到周围。 细胞分布均匀与否有一点很关键，即每种细胞是有个体差异的，别人的细胞操作 不一定适合于你.所以要靠自己摸索，且找出专属于自己细胞的一套规律，有如 下经验： 1.所有待接种的细胞悬液在种板前一定要用吸管混匀。 2.按资料记载，24 孔板的液体量为 1ml，个人也觉得 1ml 的量足矣。 3.接种时，要慢慢加样，且记得轻微旋转枪头，这样做对细胞均匀分布有一定效 果。 4.接种后最好直接放入培养箱让细胞适应培养板这个新的环境，个人认为没有必 要在室温放置一段时间。 5.根据细胞的特性，细胞均喜欢聚集在边缘生长，所以我考虑到，你的问题还有 可能是接种时的细胞密度不够，导致周边密集，中间稀疏的错觉。你的拌种密度 是多少？ 另“要慢慢加样， 且记得轻微旋转枪头“的意思就是:加样不能太快， 避免细胞在一 个加样处聚集，且注意在不同的部位进行加样，即边加边活动枪头，人为使细胞 趋于均匀分布，我个人觉得有一定的效果，不知这次我解释清楚没有

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