细胞生物学实验手册-中国医科大学

1、细胞生物学实验手册前 言 这本实验教材是为高等医学院校细胞生物学教学编写的，适用于五年制本科、七年制临床专业和研究生班。 细胞生物学实验课的教学目的，主要是通过基本技能训练以及观察分析实验结果，使学生了解并掌握有关的实验技术原理和操作方法，进而培养学生动手实践、观察分析和解决问题的能力。为达到此目的，实验内容自成体系，着眼于加强学生的基末技能训练，以及观察分析问题和科学思维能力的培养。大多数实验采用生活细胞材料，由学生自己动手取材和实验，使学生能对细胞获得生动的认识。选编了一些生物医学常用的细胞生物学基本实验，如细胞的显微测量、细胞活力测定、细胞计数、细胞组分的分级分离、细胞组分的化学反应、细胞生理活动、细胞染色体技术、细胞培养、细胞融合、免疫荧光技术、电镜技术等，为后续的课程及医学研究打下一定基础。 全书内容共23个实验，五年制本科、七年制医学专业和研究生班教学根据具体情况选择基本实验，由学生自己动手操作，少数应用大型精密仪器的实验进行参观示教，另附实验报告一册。 本教材由王芸庆主编、谢荣林副主编，参加编写的有陈兴、谢荣林、宁刚、刘冬杰、黄东阳、纪晓辉、时伟红、朱亚勤、黄集前、王明武

2、、毕卫真、张婕、三维琴和王世藩。荆永显、李虹、王序绘制插图，毕卫真负责印刷出版事宜。 教材初稿曾于1989年全国医学细胞生物学实验课培训班试用，参加该班的教师提出许多宝贵的经验及修改意见，谨此致谢。现在第四版在1993年第三版基础上对部分实验进行了补充和修改，并增加了“酸性磷酸酶的显示”实验。由于经验不足，水平有限，本教材一定还有很多缺点和错误，敬请使用者批评指正。 目 录前 言 实验室规则 (1) 常用实验动物了解和解剖器械的使用 (2) 细胞生物学实验绘图方法与要求（4）实验 一 动物细胞的基本形态观察和显微测量（5）实验 二 线粒体的活体染色及电镜照片观察（8）实验 三 液泡系的活体染色及电镜照片观察（10）实验 四 细胞中微丝的染色及微丝与细胞形态的实验观察 (11)实验 五 细胞器的光镜切片和电镜照片观察（13）实验 六 细胞生理活动的观察（16）实验 七 细胞组分的化学反应（20）实验 八 细胞核与线粒体的分级分离（23）实验 九 细胞分裂的形态观察（26）实验 十 正常细胞与肿瘤细胞常规核型的标本制备 (31)实验十一 细胞融合（36）实验十二 应用细胞融合技术制备染色体

3、提前凝集标本（38）实验十三 培养细胞的形态观察和计数（40）实验十四 细胞的原代和传代培养（43）实验十五 酸性磷酸酶的显示（46）实验十六 肿瘤细胞的软琼脂集落培养和测定（48）实验十七 电镜生物标本的制备及镜下观察（50）实验十八 整装培养细胞生物膜系统的光镜和透射电镜标本制备与观察（54）实验十九 免疫荧光抗体法检查细胞表面抗原（56）实验二十 姊妹染色单体互换标本制备与分析（58）实验二十一 银染核仁形成区的光镜和电镜标本制备及观察 (60)实验二十二 染色体扫描电镜标本制备及观察（63）实验二十三 细胞显微摄影（65） 附录一 离心机转数与离心力的换算表（67） 附录二 溶液的配制（68） 主要参考资料（77）实验室规则 一、遵守实验纪律，按时到达实验室，不得迟到或早退。实验中途因故需外出时应向任 课教师请假。 二、进入实验室之前要换好白大衣及拖鞋。 三、保持实验室安静，不许在实验室内大声喧哗及随意走动。 四、必须严肃认真地进行实验。实验期间不得进行任何与实验无关的活动。 五、实验室内各组仪器及器材由各组自已使用，不得互相调换。要爱护仪器、标本和设 备。如遇仪器损坏或不灵，

4、应及时报告任课教师，以便修理或更换，不要自行乱修。 损坏器材或设备者应按有关规定进行赔偿。 六、注意节约实验材料、药品和水、电等。 七、保持实验室内清洁整齐。实验结束后，各组必须认真清理各自的实验台面，将器材 清洗后点清数目，然后摆放整齐。班级值日生负责清扫室内卫生，关好水、电开关 和门、窗等，经教师允许后方可离开实验室。 八、动物尸体、纸片及实验废物应放到指定地点，不得随意乱丢。九、有不遵守上述要求者，任课老师将终止其实验，并取消其当堂实验成绩。常用实验动物的了解和解剖器械的使用 一、常用实验动物 常用的实验动物有蟾蜍、小白鼠、大白鼠、豚鼠、猫、兔和狗等。在医学实验中，常常根据不同的实验目的而选用不同的动物进行实验研究。例如，蟾蜍可以用于观察离体心脏搏动情况的实验，小白鼠常用于样本很大的实验(如药物的半数致死量的测定等)，猫常用于测定脑内电位的实验，而狗是局解手术中常用的实验动物。 在我们细胞生物学实验中，除应用培养细胞外，最常用的动物是蟾蜍和小白鼠，下面对其特点及基本处置做一简单的介绍。 蟾蜍 蟾蜍是两栖类动物，由于其取材方便，常用于各种实验。其细胞较哺乳类动物的细胞大得多，因此常

5、用于观察细胞形态的实验。 1雌雄鉴别 通常雄性蟾蜍较雌性的为小，且在其前肢的l3趾基部有被称为婚垫的黑疣。 2捉拿及处死方法： 常用捣髓法处死蟾蜍，即用解剖针捣毁其脑组织和脊髓。具体方法是，左手握住蟾蜍的身体和四肢，使其腹部贴着掌心，食指压住蟾蜍头部前端使其尽量腹屈。在头与躯干之间可触及一凹陷(即枕骨大孔所在处)，右手持解剖针直插入此凹陷约l2mm，随即将针尖转向头侧插入颅腔捣毁脑组织。然后将解剖针抽回并转向尾侧刺入脊椎管内捣毁其脊髓。如此直至其四肢松软，呼吸消失为止。 小白鼠 小白鼠是哺乳动物，是最为常用的实验动物。 1捉拿方法： 将小白鼠放在鼠笼盖铁网上，用右手持其尾巴向后拉，小鼠则会尽力向前蹬。用左手的拇指和食指抓住其头顶部皮肤，然后用左手小指与手掌之间夹住其尾巴。 2处死方法： 处死应以安乐死为原则，即使之无痛苦而迅速死亡。常用的方法有颈椎脱位法，断头法和二氧化碳吸入法等。断头法需用特殊的断头器，二氧化碳吸入法则将小鼠放入盛有二氧化碳的容器内即可。颈椎脱位法的具体方法是：左手拇指和食指按住小白鼠的头部，左手捉住其尾巴迅速向后猛拉，使其颈椎脱位而立即死亡。 3给药方法： 小自鼠的

6、给药途径有经口给药、腹腔内注射、尾静脉注射、皮下注射、皮内注射和肌肉注射等。我们常用的是腹腔注射。具体方法是：左手捉住小鼠(如前所述)，在其腹正中线稍外侧(避开膀胱和血管)用酒精消毒后，首先将注射针头向头部方向刺入皮下，进针12mm后，再以45°角刺穿腹部肌肉而进入腹腔(刺穿腹肌时有一落空感)。针头刺入腹腔后切勿左右摆动，以免损伤肠管或肝脏。注意每次注入的液体量应为0.10.2ml10克体重。 二、常用手术器械及操作方法： 1解剖针：用于挑、刺等。常用来捣髓处死蟾蜍，持法如执笔法。 2解剖刀(即外科手术刀)：用于各种皮肤切口和组织切除等。持法有执弓法与执笔法两种。前者用于较大力量切开较长距离的坚韧的组织，如大动物的皮肤切口等；后者则用于小力量的短距离切开，或分离皮肤和肌肉等。 3大剪刀：用于剪毛、皮肤、皮下组织和肌肉等。持法如图。 4眼科剪刀：用于剪断神经、血管、筋膜等细软组织。 5眼科镊子：用于提取神经、血管和筋膜等细软组织。 6钝头镊子：用于提取脏器、组织等。 7有钩镊子：用于提取皮肤切口等。 常用手术器械执手术刀的姿势执手术剪的姿势执手术镊的姿势执手术刀、手术剪、手术镊

7、的姿势(张之曾编)细胞生物学实验绘图方法与要求一、在仔细观察的基础上，选择典型结构进行描绘，要求真实、准确(注意各部结构的比例关系)。二、用铅笔绘图，线条要明确清晰，图的深浅明暗一律以点的疏密来表示，点要圆而一致，不得涂暗影或进行其它美术加工。 三、各部结构名称要在一侧引直线注明。各引线要平行不得交叉。四、每幅图的大小、位置在纸面上必须安排得当并注意纸面的整洁。实验一 动物细胞的基本形态观察和显微测量【实验目的】 制备不同细胞的临时制片，观察、了解细胞的基本形态，学会使用测微尺，通过测量对红细胞的进化进行分析。【实验用品】一、材料和标本 蟾蜍一只，人血液一滴。 二、器材和仪器 配有目镜测微尺的显微镜一台、载片十张、盖片三张、吸水纸、手甲苯胺兰、1甲基兰、Ringer氏液(两栖类用)。【实验内容】 一、细胞的基本形态观察 (一)原理 细胞的形态结构与功能相关是很多细胞的共同特点，在分化程度较高的细胞更为明显，这种合理性是生物漫长进化过程所形成的。例如：具有收缩机能的肌细胞伸展为细长形；具有感受刺激和传导冲动机能的神经细胞有长短不一的树枝状突起；游离的血细胞为圆形、椭圆形或圆饼形。 不论细胞的形状如何，细胞的结构一般分为三大部分：细胞膜、细胞质和细胞核。但也有例外。例如：哺乳类红细胞成熟时细胞核消失。 (二)观察方法与结果 1制备蟾蜍脊髓压片观察脊髓前角运动神经细胞。 取蟾蜍一只，破坏脑和脊髓，在口裂处剪去头部，除去延脑，剪开椎管，可见乳白色脊髓，取下脊髓放在平皿内，用Ringer氏液洗去血液后放在载片上，剪碎。将另一载片压在脊髓碎块上，用力挤压。将上面的载片取下即可得到压片。在压片上滴一滴甲苯胺兰染液，染色10分钟，盖上盖片，吸去多余染液。在显微镜下观察，染色较深

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