生物工程03基因工程1课件
139页1、基因工程,Mendel G.J. (1822-1884). 1856-1864豌豆杂交实验。,基因工程发展史,1909年Yohannsen W.L. (1859-1927) 发表了“纯系学说”首先提出了“基因”的概念,代替了Mendel “遗传因子” 的 概念。,基因概念的提出,1910年以后,Morgan T.H.等提出了基因的连锁遗传规律,1941年,Beadle G.W.等证明了基因通过酶起作用,提出了“一个基因一个酶”的假说,一个基因一个酶,1944年,Avery O.T.利用肺炎双球菌转化实验,分子遗传学的诞生,Nireberg等为代表的 一批科学家,“中心法则”的提出,原核生物的基因调控操纵子模型,1961年,Jacques Monod和 Fancois Jacob提出了原核基因调控的 操纵子模型 (operon model)。,Smith等分离并纯化了限制性核酸内切酶Hind II, 1972年,Boyer等相继发现了coR I 一类重要的限制性内切酶。,基因工程工具酶的发现和应用,1967年,世界上又五个实验室几乎同时发现DNA连接酶,特别是1970年Khorana等发
2、现的T4 DNA连接酶具有更高的连接活性。,1970年,Baltimore等和Temin等各自发现了反转录酶,完善了中心法则,使真核基因的制备成为了可能。,1972年,美国Stanford大学的P. Berg 等首次成功地实现了DNA的体外重组;,1973年,Stanford大学的Cohen等成功地利用体外重组实现了细菌间性状的转移。 这一年被定为基因工程诞生的元年。,DNA生命的秘密,1 基因是什么,1928年,英国 Griffith S型肺炎球菌:有荚膜,菌落表面光滑 R型肺炎球菌:没有荚膜,菌落表面粗糙,著名的肺炎球菌实验,结果说明?,1952年,Hershey 和 Chase 病毒(噬菌体) 放射性同位素35S标记病毒的蛋白质外壳,32P标记病毒的DNA内核,感染细菌。 新复制的病毒,检测到了32P标记的DNA,没有检测到35S标记的蛋白质, DNA在病毒和生物体复制或繁殖中的关键作用。 8年的时间,更有说服力的噬菌体实验,1958,Meselson和Stahl 大肠杆菌 15NH4CI为唯一氮源的培养液中生长若干代 被15N标记的大肠杆菌转入14NH4CI为唯一氮源的培养液中
3、 完成第一代和第二代繁殖时, 分离DNA,密度梯度超速离心 被15N标记的亲代双链DNA(记作15N/15N)密度大,在下部;14N/14N密度小,在上部;15N/14N在15N/15N和14N/14N之间,2 DNA的半保留复制,DNA合成的同位素示踪实验,重组DNA技术,又称为基因或分子克隆技术,是基因工程的核心技术。 所谓基因工程(genetic engineering)就是有意识地把一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物体中,使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产物。,3 重组DNA技术是基因工程的核心技术,重组DNA操作一般步骤:,(1)获得目的基因; (2)与克隆载体连接,形成新的重组DNA分子; (3)用重组DNA分子转化受体细胞,并能在受体细胞中复制和遗传; (4)对转化子筛选和鉴定; (5)对获得外源基因的细胞或生物体通过培养,获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。,获得需要的目的基因常用的方法: (1)直接从生物体中提取总DNA,构建基因文库(gene library),从中调用目的基因; (2)以mRNA为模板,反转录合成互补的DNA片段 (3)利用聚合酶链式
4、反应(PCR)特异性地扩增所需要的目的基因片段,等等。,1)获得需要的目的基因(外源基因),细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建,细胞内总DNA的提取分离程序,紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度。,基因文库的构建 将总DNA包含的基因组各片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上,便构成了该生物的基因文库。,反转录人工合成互补DNA,构建基因文库获取目的基因存在的问题 费时费事 内含子序列,反转录人工合成互补DNA方法的优势 获取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因,聚合酶链式反应(PCR),PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增(包括分离)一段目的基因的技术。,加入4种物质: (1)作为模板的DNA序列; (2)与被分离的目的基因两条链 各自5端序列相互补的DNA引物(20个左右碱基的短DNA单链); (3)TaqDNA聚合酶; (4)dNTP(dATP, dTTP, dGTP和dCTP)。,聚合酶链式反应(PCR),变性、退火、延伸三步曲,变性:双链DNA解链成为单链DNA 退火:部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合 延伸:以目的基因为模板,合成互补
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