16s_rdna鉴定细菌的方法
11页1、 16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分:1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进行PCR扩增,电泳检测纯度与大小。3.琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收目的片段5.目的片段测序。6.BLAST比对获取相似片段。7.构建系统进化树 试剂:1.1 培养基:通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基(培养基组分过于复杂会影响DNA的提取效果,也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。)。1.2 1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)(1L):121.1g Tris,加浓盐酸约(70ml, 60ml, 42ml),高温高盐灭菌后,室温保存。冷却到室温后调pH,每升高1,pH大约下降0.03个单位。(Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L,25) 50ml 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液与x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后,加水稀释至100ml 。Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂,Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一)1.3 0.5M EDTA(pH8.0)(1L):186.1g Na2EDTA2
2、H2O,用NaOH调pH至8.0(约20g),高温高压灭菌,室温保存。(配置方法 1. 称取186.1g Na2EDTA2H2O,置于1L烧杯中。 2. 加入约800mL的去离子水,充分搅拌。 3. 用NaOH调节pH值值8.0(约20g NaOH)。 注意:pH值至8.0时,EDTA才能 溶解。 4. 加去离子水将溶液定容至1L。 5. 适量分成小份后,高温高压灭菌。6. 室温保存。 )1.4 10TE Buffer(缓冲液)(pH7.4,7.6,8.0)(1L):组分:100 mM Tris-HCl,10 mM EDTA。1M Tris-HCl(pH7.4,7.6,8.0)取100ml,0.5M EDTA(pH8.0)取20ml。高温高压灭菌,室温保存。 1TE Buffer用10TE Buffer稀释10倍即可。1.5 10%SDS(W/V):称10gSDS,68加热溶解,用浓盐酸调pH至7.2。室温保存。用之前在65溶解。配置时要戴口罩。6、5M NaCl:称292.2gNaCl,高温高压灭菌,4保存。7、CTAB/NaCl(10%CTAB,0.7M NaCl):溶解4.1g
3、NaCl,加10g CTAB(十六烷基三甲基溴化铵),加热搅拌。用之前在65溶解。8、氯仿/异戊醇:按氯仿:异戊醇=24:1(V/V)的比例加入异戊醇。9、酚/氯仿/异戊醇(25:24:1):按苯酚与氯仿/异戊醇=1:1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。10、TAE缓冲液:使用液1:0.04 mol/L Tris-乙酸,0.001 mol/L EDTA。浓储存液50:242g Tris,57.1 ml 冰醋酸,100 ml 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)。11、6上样缓冲液(100 ml):0.25%溴酚蓝(BPB),40%蔗糖,10 mmol/L EDTA (pH8.0)(0.2 ml),4保存。12、0.6%琼脂糖凝胶:称取0.3g琼脂糖用TAE溶液配置50 ml。13、EB:10 mg/ml。称取1g溴化乙锭定容至100ml。棕色瓶室温避光保存。EB的工作浓度为0.5ug/ml。当配置50ml 琼脂糖凝胶时加入EB为2.5ul。(因EB是剧毒物质,目前很多实验室用生物荧光染料替代,常用的有Gelred等)14、蛋白酶K:20 mg/ml 溶于水,-2
4、0保存,反应浓度50 ug/ml,反应缓冲液:0.01 mol/L Tris (pH 7.8), 0.005 mol/L EDTA, 5% SDS,反应温度37-56。无需预处理。15、RNase A:10 mg/ml。25 mg RNase A 加1M Tris(pH 7.5)25ul,2.5M NaCl 15ul,无菌水2460 ul,于100加热15分钟,缓慢冷却至室温,分装成小份保存于-20。(为避免RNA的干扰,使用RNA酶降解基因组中的RNA。)1.1细菌基因组DNA提取基本步骤: 材料准备 破碎细胞或胞膜内容物释放 核算分离、纯化 沉淀或吸附核酸,并去除杂质 核酸溶解在适量缓冲液或水中基因组DNA提取所需仪器:高速冷冻离心机、恒温冰箱、移液器、水平电泳槽、紫外/荧光观测仪细菌基因组DNA提取方法综述细菌基因组DNA的提取方法主要有5种。不同的方法所选择的试剂会有所不同。1 快速微量提取法 取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中,12000rpm离心1min, 丢去上清夜,收集菌体。 加入400ul裂解液(40mMTris-醋酸,20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,
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