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16s_rdna鉴定细菌的方法

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  • 卖家[上传人]:小**
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  • 上传时间:2019-06-20
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    • 1、 16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分:1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进行PCR扩增,电泳检测纯度与大小。3.琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收目的片段5.目的片段测序。6.BLAST比对获取相似片段。7.构建系统进化树 试剂:1.1 培养基:通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基(培养基组分过于复杂会影响DNA的提取效果,也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。)。1.2 1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)(1L):121.1g Tris,加浓盐酸约(70ml, 60ml, 42ml),高温高盐灭菌后,室温保存。冷却到室温后调pH,每升高1,pH大约下降0.03个单位。(Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L,25) 50ml 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液与x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后,加水稀释至100ml 。Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂,Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一)1.3 0.5M EDTA(pH8.0)(1L):186.1g Na2EDTA2

      2、H2O,用NaOH调pH至8.0(约20g),高温高压灭菌,室温保存。(配置方法 1. 称取186.1g Na2EDTA2H2O,置于1L烧杯中。 2. 加入约800mL的去离子水,充分搅拌。 3. 用NaOH调节pH值值8.0(约20g NaOH)。 注意:pH值至8.0时,EDTA才能 溶解。 4. 加去离子水将溶液定容至1L。 5. 适量分成小份后,高温高压灭菌。6. 室温保存。 )1.4 10TE Buffer(缓冲液)(pH7.4,7.6,8.0)(1L):组分:100 mM Tris-HCl,10 mM EDTA。1M Tris-HCl(pH7.4,7.6,8.0)取100ml,0.5M EDTA(pH8.0)取20ml。高温高压灭菌,室温保存。 1TE Buffer用10TE Buffer稀释10倍即可。1.5 10%SDS(W/V):称10gSDS,68加热溶解,用浓盐酸调pH至7.2。室温保存。用之前在65溶解。配置时要戴口罩。6、5M NaCl:称292.2gNaCl,高温高压灭菌,4保存。7、CTAB/NaCl(10%CTAB,0.7M NaCl):溶解4.1g

      3、NaCl,加10g CTAB(十六烷基三甲基溴化铵),加热搅拌。用之前在65溶解。8、氯仿/异戊醇:按氯仿:异戊醇=24:1(V/V)的比例加入异戊醇。9、酚/氯仿/异戊醇(25:24:1):按苯酚与氯仿/异戊醇=1:1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。10、TAE缓冲液:使用液1:0.04 mol/L Tris-乙酸,0.001 mol/L EDTA。浓储存液50:242g Tris,57.1 ml 冰醋酸,100 ml 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)。11、6上样缓冲液(100 ml):0.25%溴酚蓝(BPB),40%蔗糖,10 mmol/L EDTA (pH8.0)(0.2 ml),4保存。12、0.6%琼脂糖凝胶:称取0.3g琼脂糖用TAE溶液配置50 ml。13、EB:10 mg/ml。称取1g溴化乙锭定容至100ml。棕色瓶室温避光保存。EB的工作浓度为0.5ug/ml。当配置50ml 琼脂糖凝胶时加入EB为2.5ul。(因EB是剧毒物质,目前很多实验室用生物荧光染料替代,常用的有Gelred等)14、蛋白酶K:20 mg/ml 溶于水,-2

      4、0保存,反应浓度50 ug/ml,反应缓冲液:0.01 mol/L Tris (pH 7.8), 0.005 mol/L EDTA, 5% SDS,反应温度37-56。无需预处理。15、RNase A:10 mg/ml。25 mg RNase A 加1M Tris(pH 7.5)25ul,2.5M NaCl 15ul,无菌水2460 ul,于100加热15分钟,缓慢冷却至室温,分装成小份保存于-20。(为避免RNA的干扰,使用RNA酶降解基因组中的RNA。)1.1细菌基因组DNA提取基本步骤: 材料准备 破碎细胞或胞膜内容物释放 核算分离、纯化 沉淀或吸附核酸,并去除杂质 核酸溶解在适量缓冲液或水中基因组DNA提取所需仪器:高速冷冻离心机、恒温冰箱、移液器、水平电泳槽、紫外/荧光观测仪细菌基因组DNA提取方法综述细菌基因组DNA的提取方法主要有5种。不同的方法所选择的试剂会有所不同。1 快速微量提取法 取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中,12000rpm离心1min, 丢去上清夜,收集菌体。 加入400ul裂解液(40mMTris-醋酸,20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,

      5、pH7.8)混匀,置于37oC水浴1hr。 然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液,混匀后于13000rpm离心15min。 取上清液,用苯酚抽提2次,氯仿抽提1次。 加两倍体积无水乙醇,1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0),-20度保存1小时后,13000rpm离心15min,弃上清液,沉淀用70%乙醇洗2次;置于室温干燥后,溶于50ulTE溶液中,置4保存备用。2 蛋白酶/SDS法制备 用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp. 4000rpm离心10min收集菌体,用Washing TE(50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0)洗菌体2次。 将菌体充分悬浮在5ml 1TE缓冲液中,先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS,轻轻混匀后50放置3h-5h。 用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次,苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次,氯仿抽提一次。(取上清液。 乙醇沉淀DNA。 用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中,70%乙醇洗2次,干燥后溶于适当1TE或ddH2O中。3u 细菌培养:细菌

      6、接种于5ml液体培养基中,37摇床(300rpm)培养过液。u 细菌收集:取1ml培养物于1.5ml EP管中,室温8000rpm离心5min,弃上清,沉淀重新悬浮于1ml TE(pH8.0)中(用ddH2O也行)。u 菌体裂解:加入6l 50mg/ml的溶菌酶,37作用2h。再加2mol/LNaCl50l,10%SDS 110l,20mg/ml的蛋白酶K 3l,50作用3h或37过夜。(此时菌液应为透明粘稠液体)。 u 抽提:菌液均分到两个1.5ml EP管,加等体积的酚氯仿异戊醇(25241),混匀,室温放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次。(上清很粘稠,吸取时应小心,最好枪头尖应剪去)。u 沉淀:加0.6倍体积的异丙醇,混匀,室温放置10min。1 2000rpm离心10。u 洗涤:沉淀用75%的乙醇洗涤。u 抽(凉)干后,溶于50l ddH2O中,取2-5l电泳。作PCR模板用。 5 CTAB/NaCl裂解法n 接两环菌(0.75ml甘油管菌液)于25ml LB培养基中,37、200r/min培养24h。n 取1.5ml菌液于1.5ml Eppendor

      7、f 离心管中,8000r/min离心5分钟,弃去上清。n 加入1.5ml TE离心洗涤后,用567 ul TE溶解菌体,混匀。n 加入30l 10%SDS和3 ul 20 mg/ml的蛋白酶K(100 ug/ml),混匀,于37温育1h。n 加入100l 5mol/L NaCl,充分混匀,再加入80l CTAB/NaCl,混匀,65温育10分钟。n 加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)(0.8ml),混匀,12000r/min离心5分钟,保留上清。n 上清中加入等体积的酚氯仿异戊醇(25241)(0.8ml),混匀,12000r/min离心5分钟,保留上清。n 加入0.6倍的异丙醇(0.48ml),轻轻混合直到DNA沉淀下来(0.5h),12000r/min离心15分钟,收集DNA沉淀,用75%乙醇(1ml)12000r/min离心5分钟洗涤DNA沉淀,真空干燥0.5h。n 用50 ul双蒸水溶解DNA, 加入终浓度为20g/mlRNaseA,4保存。n 用0.6%琼脂糖凝胶电泳鉴定提取的DNA , 每孔点样6l (4l样品+ 2l loading buffer) , 80 V , 电

      8、泳1.5小时。2.设计选择引物进行16S rDNA的PCR扩增一般细菌鉴定选择通用引物,最常用的通用引物为27F/1492R。27F:5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-31492R:5-GGTTACCTTGTTACGACTT-32.1 实验原理2.1.1 PCR多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称技术,是年代中期发展起来的一种体外扩增特异片段的技术。此法操作简便, 可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的序列的拷贝,技术虽然问世仅数年时间, 但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域,引起了生物技术发展的一次革命,目前它在分子克隆, 目的基础检测,遗传病的基因诊断,法医学,考古学等方面得到了广泛的应用。技术实际上是模拟体内DNA合成过程,是在模板, 引物和种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于聚合酶的酶促合反应,技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。 反应分三步:变性(denaturation);退火(annealing);延伸(ex tension),反应过程见图。PCR(Polymerase Chain Reaction) 的原理2.1.2

      9、16SrDNA的核酸序列分析16SrDAN是编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16SrRNA)的基因,是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”。16SrRNA的序列高度保守,可精确指示细菌之间的亲缘关系,16SrRNA的大小为1500bp左右,所含信息能反映生物界进化关系,易操作,适用于各级分类单元。目前常用的是建立在PCR技术基础上的16SrRNA基因的直接测序法,方便快捷。较之23SrDNA等看家基因而异,它具有分子大小适中,突变率小等优点,素有“细菌化石”之称。其序列包含10个可变区(variable region)和与之相同的11个恒定区(constant region),可变区因细菌而异,且变异程度与细菌的系统发育密切相关。2.1.3 PCR法的操作过程Step 1: DNA热变性;Step 2: 引物退火;Step 3: 引物延伸2.2 PCR反应标准体系 DNA模板 引物 反应缓冲液 dNTP ddH2O 耐热聚合酶2.2.1 PCR反应体系各组分的作用和使用量及反应条件v 模板:反应中量在ngng左右。且纯度较高, 以增加反应特异性。v dNTP:反应体系中达100M200M。v Mg2+:Mg2+是Taq酶的辅基浓度在2.0mM左右,浓度太低Taq酶活力降低;太高反应特异性降低

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