实验10 病毒血凝和血凝抑制试验
19页1、实验九 质粒电泳 病毒的血凝和血凝抑制,原理,与蛋白质分子类似,核酸 也是两性解离分子。在pH3.5时,碱基上的氨基基团解离,而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离,整个核酸分子带正电荷,在电场中向负极泳动;在pH值为8.08.3时,碱基几乎不解离,磷酸全部解离,核酸分子带负电荷,向正极移动。 用适应浓度的凝胶介质作为电泳支持物,发挥分子筛的功能,使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异,达到分离的目的。,载样缓冲液,其中含有的甘油可以使待电泳样品沉在点样孔底部,避免样品漂浮 其中含有的溴酚蓝(某些还含有二甲苯青)可以作为电泳速度度的指示分子,溴酚蓝的迁移位置大约相当于200 bp左右的线性DNA分子的迁移位置。,溴化乙锭,溴化乙锭含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团。它与DNA的结合无特异性。当染料分子插入后,导致与DNA结合的染料呈现荧光,DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料,而被结合的染料本身吸收302nm和366nm的光辐射。这两种情况下,被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处发射出来。 溴化乙锭可以用来检测单链或双链核酸(DNA或RNA)。但是
2、染料对单链核酸的亲和力相对较小,所以其荧光产率也相对较低。 有一些低毒产品替代:sybr green、sybr gold、gene finder,电泳准备,用透明胶封固玻璃板两头,在板一端放置电泳梳子。 用1TAEbuffer配制琼脂糖凝胶(0.24g Agaros/32ml 1TAEbuffer),在微波炉中加热至琼脂糖溶解。待溶液冷却至60,加入适量Goldview(或溴化乙锭)至微红,混匀。 将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中,凝胶厚度在5-7mm之间。 在凝胶完全凝固后,撕去透明胶,小心地将玻璃板移至装有1TAEbuffer的电泳槽中,轻轻地拔去梳子,且使缓冲液没过胶面。,DNA电泳,取9l的DNA样品与1l的10*样品缓冲液(甘油,溴酚蓝,DNA稳定剂)混合后,用微量取样器慢慢将混合物加至样品孔中。 盖上电泳槽并通电,使DNA向阳极移动。 当溴酚蓝在凝胶中移出适当距离(根据DNA的大小、1kb和3kb左右的指示剂来判断)后,切断电源,取出玻璃板,在紫外灯下观察,并拍照记录结果,估测质粒分子量的大小。,质粒DNA,3条带不是超螺旋、线性和开环这三条带。 碱法抽提得到质粒样品中不含线性
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