生物化学与分子生物学(第8版)第14章DNA的生物合成

1、,第14章 DNA的生物合成,生物体的DNA合成包括三个方面：,以DNA作为模板指导的DNA合成称为复制，即将DNA携带的信息传至子代DNA。,DNA合成也可以RNA为模扳指导合成，通常将其称作逆转录作用，见于RNA病毒。,当各种因素引起DNA损伤时，损伤DNA可进行修复合成，校正错误，完成正确合成，以保持DNA结构的稳定性和遗传信息的准确性。,第一节 DNA复制的基本特征,DNA的复制,DNA复制的特点 半保留复制 双向复制 复制的半不连续性 复制的保真性,1. 半保留复制 （semiconservation replication）,定义： 复制时，母链DNA解开成两股单链，各自作为模板（template）指导子代合成新链。子代细胞DNA双链中，一股是从亲代完整的接受过来，另一股单链则是完全重新合成。由于碱基互补，两个子细胞的DNA双链都和亲代DNA碱基序列一致。,半保留复制的实验证据,1958年，M. Messelson和F. W. Stahl用实验证实,半保留复制的意义,遗传的保守性：代与代之间DNA碱基序列的一致性，使子代保留了亲代DNA全部的遗传信息，是物种稳定性的分子基础

2、。,遗传的保守性不是绝对的：自然界还普遍存在着变异的现象。相对性是物种进化的物质基础。,2. 复制的方向和方式,复制叉,双向复制 （bidirectional replication）： 从固定的复制起点开始，同时向两个方向进行复制（最常见的）,原核生物“复制泡”,复制叉,复制时，母链DNA解链成两个单链，各自作为模板，子链沿着张开的模板进行延伸，形成的Y型结构，称为“复制叉”,复制都有特定的起始点,原核生物只有一个复制起点,E.coli只有一个复制起始点 oriC,复制都有特定的起始点,原核生物只有一个复制起点 真核生物有多个复制起点,习惯上把两个相邻的复制起点之间的DNA片段成为复制子,真核生物有多个起始位点,复制起点的一般特征: 由多个独特的短重复序列组成。 短重复序列被多亚基的复制起始因子所识别并结合。 一般富含AT，利于双螺旋DNA解旋，以产生单链DNA复制模板。,举例（真核生物）： 酿酒酵母，17个染色体，约400个复制起始点 人类基因组，104-105个复制起始点,3. 半不连续复制,因体内仅含催化53 DNA合成的聚合酶。,在DNA复制过程中，一条链是连续合成的，而另一

3、条链是不连续合成。,与“双向复制”矛盾！,冈崎片段（Okazaki fragment）,60年代，冈崎首先在电子显微镜下，利用放射自显影技术观察到,DNA复制中出现的不连续片段， 称为“冈崎片段”。,3. 半不连续复制,前导链(leading strand): 顺着解链方向生成的子链，复制是连续的。 滞后链(lagging strand): 复制方向与解链方向相反，需要等待解开足够长度的模板链才能进行复制，得到不连续的片段(冈崎片段)。,3. 半不连续复制,3. 半不连续复制,领头链的连续复制，和随从链的不连续复制，就是复制的“半不连续性”。,4.复制的保真性,严格按照碱基配对的规律 AT GC DNA聚合酶对碱基的正确选择 校读修正能力 DNA聚合酶的35外切酶活性,第二节 DNA复制的酶学和拓扑学变化,底物（dNTP） DNA聚合酶 模板（母链） 引物（RNA短片段） 其它酶类和蛋白因子,复制的反应体系：,DNA复制相关的酶系,DNA聚合酶 解旋酶 拓扑异购酶 单链DNA结合蛋白 DNA连接酶,1. DNA聚合酶,全称：依赖DNA的DNA聚合酶 （DNA-dependent DNA

4、 polymerase） 缩写：DNA-pol 活性：5 3聚合酶活性 外切酶活性,1、原核生物的DNA聚合酶,DNA-pol I,1958年，A. Kornberg在大肠杆菌里面首次发现，所以命名为DNA-pol I,可以水解两个片段（木瓜蛋白酶）： 小片段：53核酸外切酶活性 大片段：Klenow片段， DNA聚合酶活性 35外切酶活性,Arthur Kornberg （1918-2007）,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1959 Severo Ochoa, Arthur Kornberg,DNA pol I 的校读功能（1）,DNA pol I 的校读功能（2）,原核生物的DNA-pol III,是真正催化新链合成的酶,个核心酶 1个-复合物（、 6种亚基） 1对-亚基（可滑动的DNA夹子）,原核生物DNA聚合酶III,Lehningers.Principles.of.Biochemistry.4th,真核生物的DNA聚合酶5种（）,DNA-pol引物酶，起始引发,DNA-pol参与应急修复,DNA-pol线粒体DNA的复制,

5、DNA-pol 延长的主要酶,DNA-pol 校读、修复、填补缺口,真核生物的DNA聚合酶,DNA聚合酶共同特点,以dNTP为底物 具有模板依赖性，严格遵循碱基配对规律 聚合方向为53，催化核苷酸以3，5-磷酸二脂键相互连接 需引物提供游离的3-OH，不能从头合成DNA链,（1）DNA解螺旋酶（helicase）,作用：复制起始DNA的解链 消耗ATP，解开DNA双链 大肠杆菌里：DnaB,DNA双链解开后，才能作为模板进行复制,2. 解螺旋酶、拓扑异购酶、单链DNA结合蛋白,（2）DNA拓扑异构酶 （DNA topoisomerase）,解链过程中正超螺旋的形成,（2） DNA拓扑异构酶 （DNA topoisomerase）,拓扑酶I：切断DNA双链中的一股，使DNA解链不打结。DNA变为松弛状态的时候，把切口封闭。不需ATP。,拓扑酶II：切断超螺旋DNA的双链，断端通过切口，使超螺旋松弛，不需ATP。然后利用ATP，松弛状态的DNA进入负超螺旋状态，再连接断端。,拓扑酶II（原核生物：gyrase）,引入反向超螺旋，促进亲代DNA的分离解链,（3）单链DNA结合蛋白 (sing

6、le stranded DNA binding protein, SSB),作用 使DNA分子保持单链状态,SSB不会沿着复制叉移动，而是不断的与模板结合、脱离，反复发挥作用,免受核酸酶降解，保护单链的完整,3. 引物（primer）和引发体（primosome）,一段带有3-OH的RNA的寡核苷酸 直接原因：DNA聚合酶不能催化游离的dNTP直接进行聚合反应 遗传学上的意义：保证复制的准确性,引物：,引发体：由ori C, DnaA, DnaB, DnaC, DnaG（引物酶）组成的复合体,引物酶（primase）,催化生成引物， 大肠杆菌中：DnaG，真核生物中：聚合酶,以DNA为模板，自53合成RNA小片段约十几到几十个核苷酸， 3端为-OH。,引物酶与催化转录的RNA聚合酶不同,引物在复制完成后将被降解,4. DNA连接酶(DNA ligase),连接DNA链3-OH末端和相邻的5-P末端，生成磷酸二脂键。消耗ATP,连接碱基互补的双链中的单链缺口（nick）,缝合缺口：DNA修复、重组、剪接,基因工程重要的工具酶（T4 DNA Ligase）,4. DNA连接酶(DNA li

7、gase),E. Coli 基因图,DNA模板和底物必不可少的分子,模板（template） DNA双链解开为单链DNA作为模板 底物（DNA合成的原料） 四种脱氧三磷酸核糖核苷 dATP, dGTP, dCTP, dTTP,小结：DNA复制的反应体系,底物：dATP dTTP dCTP dGTP （dNTP）,聚合酶（polymerase）： 依赖DNA的DNA聚合酶,模板（template）： 解开成单链的DNA母链,引物（primer）：提供3-OH,DNA解螺旋酶、DNA拓扑异购酶、SSB、连接酶,第三节 DNA复制的过程,复制的起始 复制的延伸 复制的终止,原核生物的DNA生物合成,1、 DNA复制的起始,需要解决两个问题：,1. DNA解开成单链，提供模板。,2. 合成引物，提供3-OH末端。,解螺旋酶复制起始DNA的解链,拓扑异构酶 DNA拓扑结构的改变,单链DNA结合蛋白维持单链状态,第一步：双链的打开成单链才能作为模板,DNA在复制起始点解链,引发体:含有解螺旋酶、拓扑异构酶II、SSB、引物酶、其它起始辅助蛋白因子，及DNA复制起始区域的复合结构。,第二步：形成引发

8、体，合成引物,（Dna A）,解螺旋酶 （Dna B）,DNA拓扑异构酶II（gyrase）,引物酶,SSB,3,5,3,5,（Dna C）,（Dna G）,引物的合成,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。,引物,引物酶,引物的合成标志着复制正式开始,2、DNA链的延伸,2、DNA链的延伸,复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,复制反应的分子机理,核苷酸之间生成 3-5磷酸二脂键,-P以焦磷酸（PPi）形式被释放,原核生物DNA复制的动态过程,形成环状结构的滞后链,3、 DNA复制的终止,切除引物 53外切酶活性,冈崎片段的延长 5 3聚合酶活性,主要的酶：,主要步骤：,缺口的连接,DNA pol I（真核生物是聚合酶） 连接酶,随从链上不连续性片段的连接,DNA复制的保真性,遵守严格的碱基配对规律,聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能,复制出错时有即时的校读功能（边复制 边校对）,为什么DNA复制的时候，一定要引物？,为什么是RNA，非DNA？,思考题：关于“引物”,小结：DNA

9、复制的特点,新链只能53延长,需要底物（dNTP）,必需有引物，且其3末端核糖要有3-OH,以DNA为模板,碱基互补配对 A-T, C-G,真核生物DNA的复制,D N A 的 生 物 合 成 第 二 讲,一、真核生物与原核生物DNA复制的差异：,核小体的解聚和移位 真核生物多复制子、冈崎片段短、复制叉前进速度慢等； DNA复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚合酶/转换； 端粒酶、染色体末端复制的问题,二、真核DNA复制叉主要蛋白质的功能,Pol 负责合成引物 Pol 负责DNA复制、核苷酸切除修复和碱基切除修复 Pol 的功能与Pol 相似（其确切功能尚待定） Pol 可能和碱基切除修复有关 Pol 负责线粒体DNA复制和损伤修复,常见的真核DNA聚合酶有5种：,真核生物DNA聚合酶 已经发现15种以上,DNA聚合酶（Pol ）分子含有4个亚基：,（一）DNA聚合酶/引发酶复合物合成RNA-DNA引物,p180：催化亚基 p48：具有引发酶活性 p58：p48的稳定性和活性所必需的 p70：与组装引发体有关,功能：合成RNA引物 反应过程： 合成RNA引物 利用DNA聚合酶活性将引物延伸，产生起始DNA（initiator DNA，iDNA）短序列，形成RNA-DNA引物 Pol /引发酶脱离模板链DNA，发生DNA聚合酶转换（switch） 调节：磷酸化的调节作用,Pol /引发酶复合物,结构： p70、p34和p11组成异源三聚体 功能：,（二）RPA的功能与E.coli的SSB相似,复制蛋白A（replication protein A，RPA）,结合单链DNA 促使双螺旋DNA解旋 激活Pol /引发酶活性 为Pol 依赖复制因子C（RFC）和增殖细胞核抗原（PCNA）合成DNA所必需。 与SV40 T抗原结合，组装引发体复合物所必需 参

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